论文总字数：18146字

摘 要

ABSTRACT IV

第一章 文献综述 1

1.1 绪论 1

1.1.1 黑曲霉生产GOD的优缺点及改良空间 1

1.1.2 展望 2

第二章 材料与方法 3

2.1 材料 3

2.1.1 发酵液 3

2.1.2 主要试剂和药品 3

2.1.3 主要仪器和设备 3

2.2 方法 6

2.2.1 发酵液的预处理 6

2.2.2 发酵液的过滤 6

2.2.3 葡萄糖氧化酶的浓缩 7

2.2.4 葡萄糖氧化酶的稳定性探究 8

2.2.5 葡萄糖氧化酶制剂的精滤研究 8

2.2.6 葡萄糖氧化酶的中试提取研究 8

第三章 结果与分析 10

3.1 温度对葡萄糖氧化酶的酶活影响 10

3.2 pH对葡萄糖氧化酶的酶活的影响 11

3.3 离子强度对葡萄糖氧化酶的酶活影响 12

3.4 絮凝剂种类筛选结果 12

3.5 染菌发酵液的絮凝结果 13

3.6 不同稀释倍数与不同珍珠岩的加量对过滤效果 13

3.7 不同膜设备对葡萄糖氧化酶超滤的影响 14

3.8 葡萄糖氧化酶稳定性实验结果 15

3.9 葡萄糖氧化酶制剂的精滤结果 17

3.10 中试葡萄糖氧化酶的提取纯化结果 17

第四章 讨论 18

参考文献 20

致谢 22

葡萄糖氧化酶提取工艺开发及优化

摘 要

为了研究葡萄糖氧化酶的提取纯化工艺，降低提取纯化成本，本研究基于工业提取纯化的思路，开发了一条用于大规模生产的提取纯化工艺，利用金斯瑞提供的高产菌株黑曲霉-69#，经10L发酵罐发酵后，研究其预处理，过滤，超滤得到高浓度的葡萄糖氧化酶的液体酶液，分析其的稳定性。逐级放大工艺，最终得到适用于30T发酵罐的提取纯化工艺。实验结果表明：通过控制黑曲霉-69#发酵液预处理、过滤、超滤的操作条件，可以使葡萄糖氧化酶的提取回收率高达70%，测定其酶活为21530U/g，比初始发酵液提高了17.50倍。建立了一套操作简单快速且费用低廉的黑曲霉-69#所生产的葡萄糖氧化酶的提取纯化工艺。

关键词：葡萄糖氧化酶；提取纯化；放大工艺

GLUCOSE OXIDASE EXTRACTION PROCESS DEVELOPMENT AND OPTIMIZATION

ABSTRACT

To study the extraction and purification of glucose oxidase, reducing the cost of extraction and purification, this study based on the extraction and purification of industrial ideas developed for the extraction and purification process of a large-scale production, the use of high-yielding strains GenScript offers niger -69 # , after the 10L fermentor, study its pretreatment, filtration, ultrafiltration to obtain a high concentration of the liquid enzyme glucose oxidase solution, analyzed stability. Progressively larger craft, finally get suitable 30T fermenter extraction and purification. The results show that: by controlling the fermentation broth of Aspergillus niger -69 # pretreatment, filtration, ultrafiltration operating conditions, allows the extraction of glucose oxidase recovery up to 70%, the enzyme activity was measured 21530U / g, than the initial fermentation broth 17.50 times improved. The establishment of a set of simple extraction and purification process fast and inexpensive -69 # niger glucose oxidase produced by the.

Keywords: Glucose oxidase; Extraction and purification; Amplification process

第一章 文献综述

1.1 绪论

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase ，GOD),其能够在需氧条件下催化葡萄糖氧化成酸^{[1 ]}。高纯度的葡萄糖氧化酶，其为浅黄色粉末^[2]，不溶于乙醇、丁醇、甘油和氯仿等有机溶剂，溶于水，66%的甲醇和50%的丙酮能够使其沉淀。一般GOD的制剂中还含有过氧化氢酶，构成葡萄糖氧化酶 - 过氧化氢酶复合物，共同起作用^[3-4]。这种酶是广泛分布于自然界的，在工业生产中的一般是以曲霉，青霉等微生物为主体的来源^{[5 ]}。葡萄糖氧化酶在食品加工、酿造^{[6 ]}和医药卫生行业有着广泛的应用^{[7 ]}。在食品生产工业中，葡萄糖氧化酶被用于除去食品中所含有的葡萄糖，防止食物褐变及海鲜变质；GOD还用于食品脱氧，既能改善食品的品质也能改善饮料的品质；同时GOD还用于提高面粉的生产品质等方面^[8]。在制药行业中，GOD用于血糖及尿糖、尿酮体检测，它还可以被制成糖尿试纸或用于临床诊断的试剂盒；它还可防止口腔疾病发生^[9]。在生物工程方而，葡萄糖氧化酶可以使传感器在发酵过程中在线检测葡萄糖浓度，这是最重要的工具酶用于生物传感器。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物体内。且它也同时存在于植物和微生物体内。但它主要是在微生物的青霉和黑曲霉的菌株内。在产生GOD的同时还经常有其他杂蛋白产生，如过氧化氢酶、淀粉酶、蔗糖酶^[10]。因此，如果想进一步研究GOD的催化机理和克隆等方面的酶学性质，就必须要对GOD进行提纯。目前国内工业生产的酶纯度较低，且这种现象较为普遍，需要依赖进口，所以在国内生产高纯度酶制剂替代进口酶制剂具有重要意义。

1.1.1 黑曲霉生产GOD的优缺点及改良空间

GOD的主要霉菌来源于黑曲霉和青霉菌。 Nakamura^[11]对以上2种来源的GOD做了详细地比较后发现:前者远比后者pH与活性曲线峰宽得多。所以选用黑曲霉生产葡萄糖氧化酶。

黑曲霉(Aspergillus niger)发酵生产的葡萄糖氧化酶为胞内产物，较难提取，一般需采用细胞破碎或者固定化微生物才能提取或者应用，较为不方便。

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