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摘 要

Abstract II

第1章 文献综述 1

1.1环磷酸腺苷酸简介 1

1.2腺苷酸环化酶简介 1

1.3腺苷酸环化酶在cAMP生产中的应用 2

1.4谷氨酸棒杆菌表达体系 3

第2章 实验材料与方法 4

2.1实验材料 4

2.1.1菌株与质粒 4

2.1.2试剂 4

2.1.3培养基及培养方法 4

2.1.4主要仪器 5

2.2实验方法 6

2.2.1 基因组DNA的提取 6

2.2.2 基因克隆 7

2.2.3 表达载体的构建 8

2.2.4 感受态细胞的制备与质粒转化 8

2.2.5 DNA检测方法 10

2.2.6 重组菌株的诱导表达实验 11

2.2.7 SDS-PAGE检测目标蛋白 11

第3章 结果与讨论 13

3.1基因组提取及基因克隆 13

3.2诱导性表达质粒的构建 14

3.2.1 表达载体pXMJ19-cya的构建 14

3.2.2 表达载体pXMJ19-tacM-cya的构建 15

3.3组成型表达质粒的构建 16

3.4重组质粒的诱导表达 17

第4章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2展望 19

参考文献 20

致 谢 23

摘 要

环磷酸腺苷（cAMP）是生物体内一种具有生理活性的重要物质，由激素或其他生物分子刺激激活腺苷酸环化酶（AC），续而催化三磷酸腺苷（ATP）而形成的，常以微量形式广泛存在于动植物和微生物细胞中。作为生物细胞内的第二信使，在糖、脂肪代谢以及核酸、蛋白质合成等过程中发挥着十分重要的作用。本论文以谷氨酸棒杆菌为宿主进行AC的异源表达研究。从Arthrobacter sp. CGMCC 3584中克隆了cAMP代谢途径中的关键酶—腺苷酸环化酶的编码基因cya，采用pXMJ19质粒作为载体，构建了pXMJ19-cya重组表达质粒。进一步对pXMJ19-cya重组质粒进行了诱导型强启动子tacM和组成型启动子tuf的替换。获得重组菌E.coli BL21(DE3)(pXMJ19-cya)、E.coli BL21(DE3) (pXMJ19-tacM-cya) 、C. glutamicum 13032 (pXMJ19-cya)、C. glutamicum 13032 (pXMJ19-tacM-cya)。经IPTG诱导后，SDS-PAGE分析显示E.coli BL21(DE3) (pXMJ19-tacM-cya)目的蛋白成功得到表达，蛋白质分子量大小约为45 kDa。

关键词：节杆菌 腺苷酸环化酶 启动子

Abstract

Cyclic Adenosine monophosphate (cAMP), produced from adenosine triphosphate by adenylate cyclase, is a physiological activator, which widely exists in cells of animal, plant or microorganisms . As intracellular second messenger, it plays an important regulatory role in carbohydrate, fat metabolism, nucleic acid, protein synthesis and so on. Following its application in the field of bio-pharmaceutical and animal feed additives, the market demand is increasing. In this study, Arthrobacter sp. CGMCC 3584 capable of accumulating extracellular cAMP was used as the original strain, and the cya gene encoding adenylate cyclase was cloned. The obtained cya gene fragment was insrted into vector pXMJ19 to construct an expresson plasmid pXMJ19-cya. Furthermore, the promoter of pXMJ19-cya was replaced by promoter tacM and tuf. Recombinants E.coli BL21(DE3)(pXMJ19-cya), E.coli BL21(DE3) (pXMJ19-tacM-cya), C. glutamicum 13032 (pXMJ19-cya) and C. glutamicum 13032 (pXMJ19-tacM-cya) were obtained. SDS-PAGE indicated that the recombinant adenylate cyclase in E.coli BL21(DE3) (pXMJ19-tacM-cya) was expressed and its molecular weirht was of 45 kD.

Key Words: Arthrobacter; Adenylate cyclase; promoter

文献综述

1.1环磷酸腺苷酸简介

环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)是一种具有强生物活性的化合物，分子量329．2，具有一个由单核苷酸AMP分子中的磷酸与核糖环化而成的特征性的3’，5’．环式结构。如图1-1所示，一个cAMP分子由一个腺嘌呤、一个核糖以及一个磷酸根化合而成。成品为白色或类白色粉末，无臭，可溶于水，几乎不溶于乙醚、乙醇，对酸、碱、热相当稳定^[1]，在强烈条件下水解能使5’位上的酯键断开而失活。cAMP有许多衍生物，如6一氨基和2'-O位上发生取代形成的一系列酞基衍生物^[2]，其中双丁酞基衍生物(即DBcAMF)常用于近代研究和临床治疗，cAMP衍生物的生物活性比其母体更强^[3]。

图1-1环磷酸腺苷的结构

Fig 1-1 The structure of cAMP

1.2腺苷酸环化酶简介

腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，EC 4.6.1.1，简称AC）催化ATP生成cAMP和PPi，是生物合成cAMP的关键酶。

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