论文总字数：20024字

摘 要

绿僵菌是一种广谱的昆虫病原真菌，它能够在200余种害虫体内寄生。在害虫体内连续增殖，通过消耗宿主体内营养、机械穿透、释放产生的毒素，使得害虫死亡。因为，绿僵菌具有一定的专一性，对于人类和其它牲畜没有毒害，不会对环境产生污染、零残留、害虫无法对其产生抗药性。因此被推广使用。当前，国内对绿僵菌的研究主要集中在对其培养基的优化和培养条件的优化上。

对本实验室已筛选出的金龟子绿僵菌进行发酵条件的优化。先对出发菌株进行紫外诱变得到高产突变菌株，再通过单因素法，主要考察不同温度对其发酵的影响，发酵液初始pH对发酵的影响，接种龄对发酵的影响，摇瓶转速对发酵的影响，接种量对发酵的影响,并得出金龟子绿僵菌的生长曲线。获得单因素优化后的摇瓶最适培养条件：接种量5%，接种龄70h，发酵温度28℃，pH6.5，摇瓶转速200rpm。经过Plackett-Burman试验，测得温度、pH和转速是极显著因素。试验经过紫外诱变后筛选得到的菌株，菌体生物量从原先7.143g/L提高到8.372g/L。采用优化后培养条件发酵，菌体生物量达到8.372g/L，比紫外诱变的7.143g/L提高了14.68%。

本实验通过单因素法得到了金龟子绿僵菌的最优培养条件，为后续的发酵罐放大工艺等尊定了一定的基础。

关键词: 金龟子绿僵菌 单因素法 培养条件优化 紫外诱变

ABSTRACT

Metarhizium anisopliae is a broad spectrum of insect pathogenic fungi, can be parasitic in more than 200 kinds of insects. Metarhizium anisopliae reproduct in the insect pests. Through the consumption of nutrition, mechanical penetration, produce toxins, to kill the pests. Because, it has certain specificity, harmless to human and animal, no pollution, no residue, won't make pests cause resistance and widely used. At present, the domestic study of metarhizium anisopliae bacteria are mainly concentrated in the optimization of culture medium and culture conditions.

Our lab has screened bassiana fungus for the optimization of fermentation conditions.The mutant strain was obtained by UV mutagenesis of the departure strain.Then,by single factor method, mainly studying the effect of different temperature on the fermentation, the influence of initial pH on the fermentation liquid, the influence of vaccination age on the fermentation liquid, the influence of rotate speed of shaker on the fermentation liquid, the influence of vaccination volume on the fermentation liquid，And it is concluded that the bassiana fungus growth curve. we obtained the optimal culture conditions is divided into: Inoculum concentration 5%, inoculation of age 75h, fermentation temperature 28℃，fermentation pH 6.5, rotate speed of shaker 200rpm.After the PB test,the temperature,pH and the speed of the test were the most significant factor. After uv mutagenesis screening of strain, the mycelium biomass increased from 7.143 g/L to 8.372 g/L. Using the optimized conditions of fermentation, the bacteria biomass is 8.372 g/L, than ultraviolet mutagenesis of 7.143 g/L increased by 14.68%.

This experiment is obtained the optimum culture conditions for Metarhizium anisopliae by single factor. For the amplification process of the subsequent fermentation tank set a certain foundation.

Key Words: Metarhizium anisopliae single factor method optimization of fermentation conditions UV mutation

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 绿僵菌的种类 1

1.2菌种的收集保存与制剂开发 2

1.2.1浅盘生产 2

1.2.2孢子颗粒剂 2

1.2.3菌株保藏 2

1.2.4制剂开发 2

1.3绿僵菌的商品化及其应用 3

1.4绿僵菌发酵条件的优化 4

1.5本课题研究的目的与意义 5

1.5.1立题背景 5

1.5.2研究的目的与内容 5

第二章 紫外诱变高生长量的金龟子绿僵菌菌株 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 试剂 7

2.1.2 主要仪器和设备 7

2.1.3 菌种来源 8

2.1.4 培养基与培养条件 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 斜面菌种的活化 8

2.2.2 菌种观察 8

2.2.3 生长曲线的测定 8

2.2.4 紫外诱变实验 8

2.2.5 突变株的筛选 9

2.3 结果与讨论 9

2.3.1 初始生长曲线的绘制 9

2.3.2 紫外最佳诱变时间的选择 10

2.3.3 紫外诱变突变株与出发株生物量的比较 11

2.4 本章小结 12

第三章 金龟子绿僵菌培养条件的优化 13

3.1 实验材料 13

3.1.1 试剂 13

3.1.2 主要仪器和设备 13

3.1.3 菌种来源 14

3.1.4 培养基与培养条件 14

3.2 实验方法 14

3.2.1 斜面菌种的活化 14

3.2.2 菌种观察 14

3.2.3 种子液的培养 14

3.2.4 初始培养条件 14

3.2.5 生物量的测定 15

3.3 培养条件优化 15

3.3.1 培养温度对菌体生长的影响 15

3.3.2 初始pH对菌体生长的影响 15

3.3.3 接种龄对菌体生长的影响 15

3.3.4 转速对菌体生长的影响 15

3.3.5 接种量对菌体生长的影响 15

3.3.6 生长曲线的测定 15

3.3.7 Plackett-Burman 设计实验 16

3.4 结果与讨论 16

3.4.1 种龄对菌体生长的影响 16

3.4.2 温度对菌体生长的影响 16

3.4.3 pH对菌体生长的影响 17

3.4.4 摇瓶转速对菌体生长的影响 18

3.4.5 接种量对菌体生长的影响 19

3.4.6 优化后的生长曲线 19

3.4.7 Plackett-Burman设计实验筛选绿僵菌培养条件较显著因素 20

3.5 本章小结 21

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

致谢 26

第一章 文献综述

生物农药大体可以分为生物化学农药和生物体农药。生物化学农药是从生物体内提取分离出的一类活性物质，对病虫害有抑制作用，主要有植物源、动物源、微生物源生物化学农药三种。生物体农药是以生物活体为药物的。这些生物活体分为植物体、动物体和微生物体。

绿僵菌为活体真菌杀虫剂，在平板上其菌落形态特征类似青霉素。菌落形态为松软的绒毛状，从初始的白色到最终变成绿色^[1]。干粉制剂是把孢子经过浓缩干燥，再用吸附剂对干孢子进行吸附。干粉制剂的颜色和所使用的吸附剂种类有关。要求孢子的含水量不高于5%。分生孢子萌发率高于90%。绿僵菌在分类学上真正的系统分类地位应为真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科，是一种光谱的昆虫病原菌。在国外的使用量和防治病虫害的效果方面也不逊色于白僵菌^[2]。

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