论文总字数：15890字

摘 要

熊果苷是从各个种属植物中可分离获得的自然具有活性的物质。熊果苷具有增白提亮、祛斑的显著效果，因此是一种绿色环保的化妆品原料，在高档化妆品中得到广泛应用。因此拓展熊果苷的提取方法有利于促进熊果苷的产业化制备。

本论文以模拟熊果苷溶液为原料，对其有机溶剂萃取开展了研究。首先对萃取剂进行了筛选。通过考察不同萃取剂对熊果苷的萃取性能，结果表明溶剂C对熊果苷有较高的萃取效率。随后本文考察了pH、无机盐对溶剂萃取性能的影响。结果表明，在pH为5.5时，无水Na₂SO₄的浓度为30g/L时，溶剂C对熊果苷有较高的萃取效率，达到36.38%。同时，负载量较大。

微通道反应装置因为其中的微结构使其含有很大的比表面积，是传统搅拌反应釜比表面积的数百倍乃至数千倍，因此微通道反应装置具有极好的传质能力，能够保证物料立即均匀混合，显著提高了工作效率。本论文采用了微通道反应器作为萃取装置，分别考察了进料流速、相比、蔗糖浓度及熊果苷浓度对溶剂萃取性能的影响。经优化，确定熊果苷模拟液的微通道单级萃取条件为，萃取温度为25℃时，在进料流速为25mL/min，相比为1：1的情况下，溶剂C对熊果苷模拟液（熊果苷浓度为20g/ L，蔗糖浓度为150g/L，无水Na₂SO₄浓度为30g/L）的一级萃取率达到了56.21%，比搅拌萃取提高了19.83%。

在此基础上考察了多级萃取熊果苷的性能，通过三级萃取的策略，使熊果苷的总萃取率达到84%。

关键词：熊果苷 萃取 微通道反应器

Extraction arbutin by organic solvent

Abstract

Arbutin is a natural active substances which can be separated from a variety of plants. The effects of Arbutin on whitening and removing freckle are significantly. It is a green environmental cosmetic raw materials and used in luxurious cosmetics widely. Therefore the study of extraction arbutin is conducive to promote industrial production.

In this paper, simulation arbutin solution was prepared as raw material, organic solvent extraction was carried out. First, the extraction agents were screened. By examining the different extractant performance of arbutin, results showed that the solvent C was suited extraction agent with higher extraction efficiency. The effects of pH and inorganic salts on solvent extraction were discussed in this paper. The results showed that the arbutin extraction efficiency achieved 36.38% when pH was 5.5 and Na₂SO₄ concentration was 30 g/L.

Microchannel reactor contain a large specific surface area with microstructure, it is hundreds times and even thousands times compared with traditional stirred tank reactor surface area, so the microchannel reactor has excellent mass transfer capability. Therefore, materials are mixed uniformly, the work efficiency is improved significantly. A microchannel reactor was used as an extraction device in this paper, feed flow rate, phase ratio, solvent extraction, sucrose concentration and arbutin concentration on extraction were investigated. After optimization, the technological parameters in microchannel with single extraction were determined. The extraction temperature was 25 ℃, feed flow rate was 25 mL/min, phase ratio was 1: 1. The extraction yield of solvent C to simulate arbutin solution (arbutin concentration of 20 g/L, the sucrose concentration was 150 g/L, the concentration of anhydrous Na₂SO₄ 30 g/L) achieved 56.21%, increased 19.83% compared with control.

Based on this study, the multi-stage solvent extraction was also studied, the total extraction yield of arbutin achieved 84% by three-stage solvent extraction.

Key words: Arbutin extraction Microchannel reactor

目 录

摘 要

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2熊果苷的生产方法 2

1.2.1天然产物提取法^[6-7] 2

1.2.2植物组织培养法^[9-10] 2

1.2.3化学合成法^[11] 3

1.2.4 酶转化法^[13] 3

1.3熊果苷的分离纯化方法^[15-18] 4

1.3.2吸附法 4

1.4有机溶剂萃取法研究进展 5

1.5萃取方式 5

1.5.1搅拌萃取法 5

1.5.2微混合萃取法^［27］ 5

1.6熊果苷的检测方法 6

1.7本课题的研究目的和意义 6

第二章 材料与方法 7

2.1 实验试剂 7

2.2 仪器与设备 7

2.3 实验方法 7

2.3.1熊果苷模拟母液的萃取分离 7

2.3.2 熊果苷模拟液的多级萃取 8

2.4.1 熊果苷的检测 8

2.4.2 有机溶剂萃取平衡分配系数与萃取率的计算 8

2.4.3 萃取剂熊果苷负载量Q的计算 8

第三章 结果与讨论 9

3. 1 萃取剂的选择 9

3. 2 pH对萃取剂性能的影响 9

3.3 Na2SO₄ 对萃取性能的影响 10

3.4原料液进料流速对萃取性能的影响 10

3.5 不同相比对萃取性能的影响 11

3.6熊果苷浓度对萃取性能的影响 11

3.7蔗糖浓度对萃取剂性能的影响 12

3.8 饱和状态萃取剂对萃取剂性能的影响 12

3.9熊果苷模拟液的多级萃取 13

第四章 结论与展望 14

4.1 结论 14

4.2 展望 14

致 谢 17

第一章 文献综述

1.1 前言^[1-2]

熊果苷其化学名称为熊果叶甙，分子式C₁₂H₁₆O₇，分子量为272.25，是一种自然的活性物质，能够植物熊果中提取获得。高纯度的熊果苷为白色的针状结晶物质或者为粉末状物质，存在两种差相异构体，即α型及β型，化学学名分别为4－羟苯基－α－D－吡喃葡萄糖苷和4－羟苯基－β－D－吡喃葡萄糖苷，分子结构如图1-1所示

图1-1 α-熊果苷和β-熊果苷

熊果苷易溶于水、低级醇的水溶液，不溶于醚类、卤化物等，熔点为198～201℃。熊果苷在酸性物质存在的环境下不够稳定，容易被水解析。熊果苷的水溶液会与铁盐生成能够被水溶解的浅黑色络合物，并且可和碱式乙酸铅产生沉淀物质。在配方中添加适量的维生素E对其有稳定作用，而在配方中加入适量的亚硫酸氢钠可防治膏体变成黑色。

熊果苷中包含有抵抗炎症、遏制病菌、镇咳、化痰、平复咳嗽的作用，而且含括自然的增白活性的因素，同时应用于临床方面得到普及。含有熊果苷的药剂等常常使用于治愈气管炎、感染性的泌尿类的疾病、皮肤类疾病、敏感的征象及发炎病状^[3]。此外熊果苷具有自然的增白效果，其生物色素作用机理已经有报道：酪氨酸酶活性能被熊果苷能够遏制，因此使皮肤发生增白提亮的结果^[4]。在不影响细胞的繁殖的同时，熊果苷能够快速的渗透进人体肌肤里，能够立竿见影地遏止住人体皮肤中的生物酪氨酸酶的生物活性，使黑色生物色素的形成被阻遏。通过熊果苷与酪氨酶的结合，阻遏多巴、多巴醌的产生，使黑色生物素快速分解并排出体外，因此皮肤生物色素的积累的沉淀物得以去除，达到祛除色斑和黑点的功效^[5]。

近几年来，由于熊果苷在有增白功效的化妆品、祛斑美肤的化妆品的效果显著，并具有安全绿色的特点，因此熊果苷在护肤品中的运用发展迅猛。

1.2熊果苷的生产方法

1.2.1天然产物提取法^[6-7]

最初是将天然熊果苷从植物中提取出来。1930年报道熊果苷被从厚叶岩白菜的叶子中提取出来，从此以后接踵而至的是，在各个类别的草本植物的树叶（如：乌饭树叶、越橘树叶、熊果树叶和梨树叶）中均能够将熊果苷提取出来。

主要利用的方法是铅盐法。一般的步骤为:搜集含有熊果苷的植被的叶子，处理并加工树叶→以纯水或者乙醇作为萃取剂，进行提取反应→将萃取液过滤出，再用纯水清洗过滤后获得的物质，最后并归滤液→用饱和处理的中性的乙酸铅的水溶液处理过滤后的液体，并且将过滤液中包含有的有机酸、黄酮类等因素的沉淀，使其沉底成不溶性铅盐→将不溶性的沉淀物质过滤出来，通过加入碱性物质碱化的铅的水溶液使过滤液中产生熊果苷的沉淀，最后水不溶性的铅盐可以生成→将不溶性沉淀物过滤出来去除，将沉淀物置于新沸过冷的纯化水中，使之悬浮在纯化水中，使硫化氢气体被通入进悬浮液中，溶液中析出胶态的PbS物质，调节pH值，为了避免液体中的熊果苷发生水解析的现象→通过抽滤，获得PbS凝胶沉淀，并用纯水洗濯滤物，归并滤出的液体→通过降低压强的方式，过滤出的液体得以浓缩，就可以获得符合美妆品要求规定的熊果素的固体颗粒离析出。在1996年，松田^[8]等获得了50%乙醇的提取物来自不同种的熊果叶中提取出，后续的实验中，纯化后获得粗制成熊果苷产品，占了熊果叶干重的5%，也可采取柱色层分析的方法。采用普通常见的分离技术如可以采用大孔吸附树脂去吸附固体液体物质，从萃余液中获得熊果苷产物。

熊果叶中熊果苷的含有量较低，而且实验操作复杂，获得的熊果苷纯度不高，另外天然植物中的熊果苷主要为β-熊果苷，美白效果远不如α-熊果苷，故经济效益不高。

1.2.2植物组织培养法^[9-10]

该方法的要领是，由于强烈的植物中细胞的糖基化效应，作为外源的氢醌可以被制备为熊果苷。林口能孝等制成熊果苷的方式是采用三万花的细胞培养方式。该实验采用的是在避光暗处，采用摇床设备进行反应，将三万花细胞培养在培养基中，培育时间为8天。培育期结束后，过滤出培养基后，搜集到的细胞改换在新鲜培养基中再培育，时间为四天。将氢醌的水性溶液添加到新制的培养基中，实验中所使用到的氢醌浓度为22g/L，培育结束后能够获得熊果苷该物质。

1.2.3化学合成法^[11]

该实验方案主要的原料是以葡萄糖与氢醌为主，通过化学合成方式来制备熊果苷。著名的柯尼希斯-克诺尔反应^[12]是制成熊果苷的主要依据，是将乙酰化的葡萄糖使用溴取代的方式后获得溴代四乙酰葡萄糖，接着再在碱化的催化剂作用下，与单侧链被保护的氢醌缩聚合成能够获得五乙酰葡萄糖，脱乙酰基能够获得熊果苷。

当然，在化学合成熊果苷的过程中，大量的加保护类的基团以及脱去保护类的基团的步骤是必须的，可是相比之下采用化学中的合成的方式收获率较高，成本花费较低，是绝大部分的熊果苷的制备来源。

1.2.4 酶转化法^[13]

核苷磷酸化的糖分子是转移酶的底物，通常为UDPG ，但不易获得。在生物体内，蔗糖裂解的关键是利用被磷酸化的蔗糖酶，产生α-D 葡萄糖- 1-磷酸酯和果糖。蔗糖上葡萄糖基容易被α-D 葡萄糖- 1-磷酸酯和果糖连接到氢醌上，获得 α-熊果苷^[14]。

具有催化作用的糖苷酶的制成 α-熊果苷的转移糖基的反应的过程如图 1-2。为了节制供应制备体的水解和熊果苷的水解，应当选取合适的酶和控制反应条件。

图1-2 糖基转移反应

总而言之，酶的合成转化方法具有环保、高效率的选择性。微生物是大量酶原的来源，可以使用 DNA的重组技术来解决自然微生物里酶的含量不高的问题，基因片断在载体的作用下，进入新的细胞中进行表达，才能获得大量的酶。

1.3熊果苷的分离纯化方法^[15-18]

分离纯化熊果苷的方式种类繁多。根据报道，分离纯化提取熊果苷的方式包括了吸附法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、高效液相色谱的分离技术等。大孔吸附树脂法的应用研究最普及，报道最多。

1.3.1超声波辅助提取法

超声波提取法是使用外场来实行增强纯化过程，使用溶剂来提取当中有效的化学的成分。提取过程中，超声波会产生空化的影响、局部放热现象。超声空化是留在物质中的微气核在超声场的影响下上下振荡，空化作用会引起小部分的温度上升压强增大，同时溶剂中会引起物质消融性能增强。相较于其他溶剂的提取方法，超声提取花费时间少、生产效率快、反应时需要条件温和，同时超声所具有的特殊的条件，使化学成分更容易溶出。

1.3.2吸附法

吸附法主要采用大孔吸附树脂来分离两相液体，原因是大孔树脂能够大量的吸附物质，容易分离两相，并且能够将产品附着在其上，再生处理后能够循环使用，吸附分离的速度快，便于操作，经过处理后的样品纯度高。相比于传统的处理方法，消耗的溶剂量较少，使用的溶剂种类少，没有残留，不会造成污染。由于大孔树脂具备的优势较多，采用大孔吸附树脂方法分离纯化熊果苷被广泛的使用，特别是天然产物的分离，也适用于水溶性化合物的分离。

Satoshi Kitao等 ^[19]合成熊果苷的底物为：蔗糖和氢醌，催化剂为：蔗糖磷酸化酶。分离纯化试验中采用活性炭吸附柱，采用去离子水洗脱，乙醇水溶液（20%）分离熊果苷和氢醌两种物质。分离α-熊果苷和氢醌的方法是ODS-HPLC，目的是将熊果苷的溶液冻干，得到熊果苷粉状产品。

Prodanović RM等 ^[20] 合成熊果苷的底物为：麦芽糖和氢醌，催化剂：α-葡萄糖苷酶。分离纯化实验采用Purolite MN102大孔树脂柱，蒸发并浓缩用乙醇水溶液（96%）洗脱后的洗脱液。熊果苷和氢醌分离采用凝胶色谱，最后用洗脱剂（乙酸乙酯：甲醇=9:1）进行洗涤，将洗涤液浓缩，获得熊果苷物质。

Eun-Seong Seo等 ^[21]合成熊果苷的底物：蔗糖和氢醌，催化剂：葡聚糖蔗糖酶。采用丁醇为萃取剂分离产物与底物，使用旋转蒸发仪装置浓缩丁醇，使用硅胶柱吸附浓缩液，最后用洗脱剂乙腈（90%）进行，获得熊果苷粉状物质。

Dong-Ho等^[22]合成熊果苷的底物为：蔗糖和氢醌，抗氧化剂：抗坏血酸，催化剂：淀粉蔗糖酶。将反应液沸腾5 min后，采用硅胶柱进行洗涤液的分离，用洗涤剂（乙酸乙酯：甲醇：水=40:4:1）进行洗脱，获得熊果苷产品。

刘春巧等^[23]选取合成熊果苷的菌株为：嗜麦芽黄单胞菌BT-112(Xanthomonas maltophilia BT-l 12)。为了沉淀下絮凝，采用乙醇加入到发酵液中(体积比：乙醇比：发酵液=2：1)。过滤出絮凝物，并使用旋转蒸发仪装置将滤液转蒸发浓缩，将浓缩液体离心后获得上清液。分离纯化试验中，采用S-8大孔树脂柱，用乙醇水溶液（25%）进行洗脱，最后用活性炭进行脱色，除去活性炭后即可获得熊果苷晶体物质。

陈思民等^[24]选取合成熊果苷的出发菌株为：米曲霉PL11，底物：氢醌、麦芽糖。离心发酵转化液后，降低压强以浓缩转化液。本实验采用AB-8大孔树脂吸附浓缩后的发酵液的生物色素，蔗糖、α-熊果苷和氢醌经过乙醇水（30%）溶液洗脱。熊果苷和氢醌的分离采用的是硅胶，最后用洗脱剂（乙酸乙酯：甲醇：水=3:1:1）进行洗涤，最后降低压强，将洗脱液浓缩，获得熊果苷结晶物质。

1.4有机溶剂萃取法研究进展

有机溶剂萃取的方式是使用最为广泛的提取方法，可以选用的溶剂物质为：甲醇、乙醇、丙酮、石油醚等。有机溶剂萃取法主要依靠提取物在不同物质中的分配系数有差别而可以分开的方式。若两相有机溶剂中所需提取的物质的分配系数D相差越大，则分开的效果越好^［24］。

张春秀^［26］等萃取熊果苷的萃取剂为：乙醇。经过萃取、过滤，滤液后，通过降低压强来蒸馏萃余液，获得粗制熊果苷。乙醇是萃取剂，拥有产物的获得效率高的优点。由于生产乙醇成本较高，因此乙醇作为萃取剂的萃取方式难以推广。

1.5萃取方式

1.5.1搅拌萃取法

搅拌萃取是在恒温下将萃取剂与原料液在反应器内混合并加以搅拌，然后静置分层。该方法具有设备简单的优势，但大规模生产中需要占用较大的设备体积，不能连续化操作。

1.5.2微混合萃取法^［27］

微反应器设备由于其内部的微结构使得微反应器设备具有极大的比表面积，可达搅拌釜比表面积的几百倍甚至上千倍。因此微反应装置有着极好的传质能力，可以实现物料的瞬间均匀混合，此外微型反应通道的无扩大效应，采用扩大微通道的规模来扩大工艺。因此许多在普遍的反应装置中无法实现的实验都可以微反应设备中实现。

1.6熊果苷的检测方法

大部分熊果苷使用在美妆类的产品，作用于人体肌肤的几率较大，所以检测产品中的熊果苷含量尤为重要。李菲等^[28]使用变换红外光谱法的方式，预先充入氮气，通过紫外的吸收以及荧光光谱来测定产品中熊果苷的浓度。该检验方法测量精度优良，具备高稳定性。

高速液相色谱法是报道较为普遍的检测方式，如张婷等^[29]采用HPLC检测熊果苷，采用C18柱，流动相：甲醇-水的混合液（甲醇/水的体积比为1:4），检测时使用的波长:282nm。

1.7本课题的研究目的和意义

本课题针对熊果苷酶转化液中残糖浓度和色素含量较高的特性，拟采用有机溶剂萃取法提取熊果苷。首先选择出适宜的机溶剂，然后考察pH、盐浓度对萃取性能的影响，为了提高萃取效率，将微通道混合反应器应用于萃取，考察进料流速、水油相比值、残留蔗糖的浓度、熊果苷浓度对萃取性能的作用，优化提取工艺。最后选取多级萃取的方式提高熊果苷的萃取率。本课题的相关研究成果可为熊果苷的生产工艺开发提供基础数据，具有很强的实用性。

材料与方法

2.1 实验试剂

表2-1 实验试剂

本研究采用的熊果苷模拟液组成为：熊果苷20g/L，蔗糖 150 g/L。

2.2 仪器与设备

表2-2 实验仪器与设备

2.3 实验方法

2.3.1熊果苷模拟母液的萃取分离

配制模拟熊果苷结晶母液（熊果苷20g/L， 蔗糖 150 g/L），按照一定的体积加入有机溶剂进行萃取，在一定温度下采用微通道萃取，静置分相后，检测水相中熊果苷的浓度，计算熊果苷在水相和油相中的平衡分配系数D、萃取剂（油相）对熊果苷的负载量Q和对熊果苷萃取率E。考察蔗糖浓度、pH、Na2SO4、熊果苷浓度、萃取相比、进料液流速等因素对萃取剂C萃取熊果苷的性能影响规律的研究。在此基础上对熊果苷模拟液进行萃取

分离。

2.3.2 熊果苷模拟液的多级萃取

萃取后的水相，继续按照一定的比例加入萃取剂，通过取样测量出多次萃取后的熊果苷含量。

2.4 分析方法

2.4.1 熊果苷的检测

熊果苷的含量采纳高效液相的方法（HPLC）来检测。

2.4.2 有机溶剂萃取平衡分配系数与萃取率的计算

当达到萃取平衡后，熊果苷的分配系数D计算公式为：

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