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摘 要

产电微生物通过氧化降解有机底物从而产生电子，而电子则通过电子传递链传达到电子受体的阳极电极上，再通过外接电路以到达阴极，最终还原阴极电子受体，循环往复不断产生电流。

在产电微生物体内产生电子即在生物氧化的过程中，NADH氧化途径是体内最主要的生物氧化途径。在此途径中，NAD 和 NADH伴随着质子和电子的产生相互交替转化。NAD 合成酶存在于大多数生物体中，是NAD 从头合成途径和再生途径共有的最后一步催化反应的关键酶，在 NAD 合成方面占着极其重要的位置。

将来源于E_.coli DH5α中编码 NAD 合成酶的基因nadE连接至可在大肠杆菌中稳定存在并表达的的穿梭质粒载体PET22-b中，从而获得可以高效表达的重组质粒PET22-b-N，以实现NAD合成酶在E.coli BL21中的过量表达。利用金属离子层析柱（Ni-NTA琼脂糖凝胶）进行亲和纯化分离纯化方法纯化粗酶液，得到的结果是：比活力是13.98U/mg，回收率达到64.45%。最适酶反应温度是40℃、最适pH为10.0，Ba² 对酶活有明显促进作用，Cu² 、Ca² 对酶活有一定抑制作用，动力学常数Km值为0.81，Vmax为14.49U/mg，为进一步研究NAD合成酶提供了基础。

关键字：NAD合成酶 基因克隆 酶学性质

Abstract

Electrogenesis microorganisms oxidtive degrade organic substrate to produce the electron and the electrons through the electron transport chain are passed to the electron acceptor on the anode electrode, then through the external circuit to reach the cathode, ultimately reducing the cathodic electron acceptors, the cycle will continue to generate an electric current.

Microorganisms produce the electron is a biological oxidation process， the NADH oxidation pathway is the main biological oxidative pathways in this progress. In the oxidation pathway of NADH，NAD and NADH transformation into each other is accompanied by the generation of protons and electrons. NAD synthetase exists in most organisms，is a key enzyme of the final step of the NAD de novo synthesis pathway and regeneration pathways. It plays an important role in the synthesis of NAD .

Connecting the gene nadE which codes the NAD synthetase come from E.coli DH5α to the plasmid vector PET22-b which can stable existence and express in the Escherichia coli and obtain high expression of recombinant plasmid PET22-b-N.Also we can over express the NAD biosynthesis in E.coli BL21 , in order to further study the enzymatic properties of NAD synthetase. Using metal ion chromatography column (Ni - NTA agarose gel) for affinity purification separation purify the enzyme fluid, the result is: activity is 13.98 U/mg, recovery rate reached 64.45%.The optimal enzyme reaction temperature 40 ℃, the optimum pH is 10.0, Ba² have obvious promoting effect to enzyme activity, Cu² , Ca² has certain inhibitory effect on enzyme activity, kinetic constant k value of 0.81, Vmax is 14.49 U/mg, these results provides a foundation for further study.

Key Words：NAD Synthetase；Gene Clone；Enzymatic Properties

目 录

摘要 I

Abstract II

1 文献综述 1

1.1引言 1

1.2 NAD合成酶的分类 1

1.3聚合酶链式反应简介 2

1.4聚合酶链式反应的设计 2

1.5酶学性质研究 2

1.6紫外分光光度计测定酶活力 2

1.7研究目的与意义 2

2 实验材料与方法 3

2.1实验仪器及材料 3

2.2试剂盒及工具酶 4

2.3实验试剂 4

2.4菌株与培养基 5

2.5实验内容 5

2.5.1大肠杆菌DH5α全基因组提取 5

2.5.2 PCR扩增 6

2.5.3重组质粒连接 6

2.5.4表达菌株转化及鉴定 7

2.5.5诱导表达与粗酶制备 7

2.5.6蛋白纯化 8

2.5.7蛋白含量测定与酶活测定 8

2.5.8酶学性质研究 8

3 结果与讨论 9

3.1大肠杆菌 DH5α 基因组 DNA 的提取 9

3.2 PCR结果 9

3.3表达系统的构建与鉴定 10

3.4重组菌的诱导表达与粗酶制备 10

3.4.1 NADH 的标准曲线 11

3.4.2 蛋白含量标准曲线 11

3.5蛋白纯化 12

3.6 酶学性质研究 12

3.6.1 pH对NAD合成酶活性和稳定性的影响 12

3.6.2温度对NAD合成酶活性和稳定性的影响 13

3.6.3金属离子对NAD合成酶活性的影响 14

3.6.4NAD合成酶的动力学参数测定 15

参考文献 16

致谢 19

1 文献综述

1.1引言

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸是一种参与生命体多半氧化还原反应的重要辅酶^[1-2]，其主要存在形式为主要为两种：氧化态的NAD 和还原态的NADH。NAD 和NADH可发生可逆性的转变，因此，生物体内的NADH/NAD ^[3]比率反应了生物体内的氧化还原状态，对微生物的代谢网络有很重要的影响。微生物体内NAD 及NADH水平的变化对微生物的代谢水平有极显著的作用。在微生物体内改变NAD 及NADH水平的方法有很多，NAD从头合成途径就是其中一条途径^[4-8]（如图1.1）。

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