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摘 要

在工业微生物催化过程，菌株对发酵环境中有毒有害物质的耐受性高低对产量有很大的影响。本课题着重研究提高赖氨酸高产工业菌株在发酵后期的恶略环境中维持产量的方法，拟采用“基因组复制工程辅助的连续进化”(Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)技术，改良菌株的耐盐性，借以提高产品产量。

关键词：随机定向进化 连续进化 GREACE 高通量筛选

Directed evolution of an high-salt tolerant lysine industrial strain

Abstract

In industrial microbial catalysis processes,the strain’s tolerance abilty level against environment of toxic and harmful substances has a great influence on the yield.So,in order to improve product yield,increase strains salt tolerance should be a good way.This paper focuses on find out the methods that could improving high-yield industrial lysine production strains to maintain lysine yield in the harsh later period fermentation environment,methods to be adopted is Genomme replication engineering assisted continuous evolution (GREACE) technology.

Keyword: Random directed evolution；Continuous evolution；GREACE；High-throughput screening

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

第二章 实验原理 3

2.1 连续进化技术的选择 3

2.2 GREACE技术的原理及优势 3

第三章 利用dnaQ进化产赖氨酸菌株3X-1 6

3.1出发菌株背景 6

3.2载体构建 6

3.2.1实验材料 6

3.2.2引物设计 7

3.2.3实验方法 7

第四章 赖氨酸高产菌株3X-1的连续进化 11

4.1菌株背景 11

4.2培养基配方 11

4.3实验方法 11

第五章 大量菌株进行赖氨酸发酵检测的高通量筛选方法 13

5.1 高通量筛选的必要性 13

5.2深孔板中赖氨酸检测方法的建立 13

5.2.1改进的茚三酮染色法 13

5.2.2改进的方法 14

5.2.3加热方法可行性测试 14

5.2.3最适检测波长验证 16

5.3深孔板培养条件优化和验证 18

5.3.1深孔板培养体系对高产低产菌株区分能力的验证 18

5.3.2深孔板培养体系中缓冲液最适使用量测试 19

5.3.3结果 21

第六章 高产耐受菌株的筛选 22

6.1初筛 22

6.2复筛 23

6.3高产耐受菌株纯化 24

第七章 高产耐受菌株的摇瓶发酵测试 26

7.1材料和方法 26

7.2数据处理 26

第八章 分离菌株的基因组分析 28

8.1基因组提取与测序 28

8.2 dnaQ引导的突变高产和耐受菌株基因组分析 28

第九章 下一步工作 29

参考文献 30

致谢 32

第一章 文献综述

1.1研究背景

L-赖氨酸是脂肪族氨基酸的一种，化学名称是2,6-二氨基己酸，是人和动物生长、发育所必须且自身不能合成的八种必需氨基酸之一，是谷物蛋白第一限制氨基酸，必须从外界摄取。赖氨酸的生理作用包括帮助生物吸收和利用其它营养物质，尤其是对高蛋白食物的吸收和利用起关键作用，对达到营养均衡，促进生物健康生长发育有着重要意义，故在食物和饲料中添加适量的赖氨酸，其蛋白的生物价值会有很大的提高。也因此，赖氨酸是目前全球使用量最大的氨基酸类饲料添加剂，约90% 被用作饲料添加剂，约5% 用作食品添加剂，其余5%用作医药中间体。

中国赖氨酸市场除国内消耗外，还有向国外出口的部分。受原料价格和供求关系的影响，生产企业面临着较大的成本压力，迫需工艺的改进^[1]。而目前，L-赖氨酸的工业化生产方法主要有三种：蛋白水解法、化学合成法和微生物发酵法^[2]。其中，氨基酸的L-型立体专一性决定了微生物发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷，具有生产成本低、生产强度高、特异性高、环境污染小等特点，成为L-赖氨酸工业化生产应用最广的方法^[3]，即以玉米淀粉乳制液体葡萄糖或结晶葡萄糖为主要原料，由特定微生物菌种在一定配方培养基及适宜培养控制条件下经生物发酵后提取、精制后获得。

微生物发酵产赖氨酸的工艺中，受工厂人员关注的影响因素包括温度、pH、溶氧、消泡和营养盐配方等^[4]，其中营养盐部分集中于各种盐成分作为营养成分的作用。而众所周知，很多工业菌株的产物对菌株本身的生长是不利的，以最为典型的酵母酒精发酵为例，酒精对酵母本身有一定的毒性，达到一定浓度时，会抑制酵母菌的生长和酒精的发酵能力^[5]，菌株产酒精能力高于菌株对酒精的耐受能力的情况也确实存在^[6]。在本实验室先前的发酵实验中发现，持有的赖氨酸高产工业菌株接种在添加了自身发酵可以达到的浓度的赖氨酸的LB液体培养基中生长情况明显低于接种于普通LB液体培养基，并由此猜测已有赖氨酸高产工业菌株对发酵后期不利环境的耐受性成为制约产量的可能条件之一，并进一步猜测毒性的主要来源是菌株本身产生的高浓度赖氨酸盐。而在微生物发酵

产赖氨酸的工艺中，发酵末期同样存在着高盐度的不利环境，如若普通赖氨酸工业菌株难以在此环境下维持较高的生长量和新陈代谢活性，必然会导致产量增加困难，产品单耗增加，故提高菌株的耐盐能力是进一步降低赖氨酸生产成本的可行途径。

第二章 实验原理

2.1 连续进化技术的选择

细菌的耐盐机理较为复杂，大体上分为两类^[7]。第一类是Na /H 反向运输系统，广泛地分布在细菌、动物和植物的细胞膜中。在很多生物中这种反向运输体在运输钠离子穿过细胞质膜时起着非常重要的作用，研究表明, 大肠杆菌有两种基因编码了Na /H 反向运输体, 分别为nhaA 和nhaB, 这两种基因的产物对于大肠杆菌的耐盐性是非常重要的^[8]。第二类是特殊的代谢途径及产物，早期是在胞内积累一定量的K ，稍后合成氨基酸类，糖类，季胺类化合物等带负电荷的相容性溶质，维持渗透压，保护胞内酶活力^[9]。

出于对耐盐机理复杂性和理性进化庞大工作量的考虑，本实验采用一种特殊的非重组的体内随机进化方式，“基因组复制工程辅助的连续进化”，Genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE技术，该技术基于“边突变，边筛选”的设计原则，通过对基因组复制校正机制的扰动，建立胞内连续诱变机制，在持续存在并不断增强的筛选压力下培养该细胞，即可实现突变-筛选两个过程的耦合，从而使高效连续的菌株进化成为可能^[10]。

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