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摘 要

碱性蛋白酶自上世纪被发现后，在几十年之内其相关产业迅速发展，时至今日，碱性蛋白酶已经走进了我们的生产活动，走进了我们的日常生活。从山东青岛海域获取到的海洋细菌样本中，发现了能够生产碱性蛋白酶的细菌，通过对产碱性蛋白酶菌株的形态观察、生化生理实验后，筛选出了一株产酶能力相对优秀的菌株：10号菌株，初步测定其酶活力达到了92U/ml，随后对初始pH值、培养时间、装液量以及培养温度的发酵条件进行了优化实验，确定其最优条件下的酶活力能达到119U/ml。实验结果表明青岛海域内存在优良的产碱性蛋白酶细菌；而10号菌株将来可作为良好的出发菌株进一步改良、驯化，使得其产物碱性蛋白酶的优良特性得到进一步的激发，期待它能适用于工业应用。

关键词：产酶 碱性蛋白酶 海洋细菌 筛选 发酵条件优化

Abstract

The alkaline protease was discovered since last century, its related industry rapid development within decades. Today, the alkaline protease had entered our production activities, walked into our daily life. From Shandong Qingdao sea access to the Marine bacteria samples, I found that the bacteria can produce alkaline protease. Through to the production of alkaline protease strains morphology observation, biochemical physiological experiment, selected a plant enzyme production capacity is relatively excellent strains: 10 strains. Preliminary determination of the enzyme activity reached 92 u/ml, then the initial pH, culture time, fluid volume and temperature of fermentation conditions, the optimization experiment, determine the optimal conditions of enzymatic activity can reach 119 u/ml. The experimental results show that the Qingdao sea area there is excellent production of alkaline protease in bacteria. Strain can be used as a good start in the future and 10 strains of further improvement, domestication, inspire their product excellent characteristics of alkaline protease, in order to apply to industrial applications.

Key Words:Enzyme production; Alkaline protease; Marine Bacteria; Filter; Optimization of fermentation conditions

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 蛋白酶介绍 1

1.2 理化性质 1

1.3 生产状况 2

1.4 选育方式 3

1.4.1 传统诱变育种或复合诱变选育高活力菌株 3

1.4.2 利用基因工程技术选育高产菌株 4

1.4.3 利用原生质体再生育种技术选育碱性蛋白酶高产菌株 4

1.4.4 利用蛋白质工程技术选育高产菌株 5

1.5 应用前景 6

第二章 实验方法与分析 10

2.1实验仪器与材料 10

2.1.1 实验材料 10

2.1.2 实验仪器 12

2.2实验方法 13

2.2.1 取样 13

2.2.2 菌株分离纯化 13

2.2.3 产碱性蛋白酶初筛 14

2.2.4 产碱性蛋白酶复筛 15

第三章 实验结果 17

3.1菌株分离纯化 17

3.2产碱性蛋白酶细菌的初筛 17

3.3产碱性蛋白酶细菌的复筛 18

3.3.1 标准曲线的制作 18

3.3.2 产酶菌株的复筛 19

第四章 结论与展望 20

4.1 结论 20

4.2 展望 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1 蛋白酶介绍

碱性蛋白酶（alkaline protease），碱性蛋白酶的活性相关中心含丝氨酸，所以也叫丝氨酸蛋白酶。比较常见的碱性蛋白酶有两种，一种是Novo蛋白酶，另一种是Carsberg蛋白酶，两者的性质与构造都很相似，分别含有275和274个氨基酸残基，而且都由一条多肽链构成。当pH在 9～11之间，碱性蛋白酶结构稳定不易变性，但是当pH值低于6或大于11时，碱性蛋白酶会迅速失活。由于碱性蛋白酶缺少半胱氨酸形成二硫键，所以常常会被来自大豆、马铃薯和大麦的蛋白酶抑制剂所抑制。碱性蛋白酶不但可以水解肽键，还能水解酰胺键、酯键；甚至还可以转酯和转肽。酶具有专一性，碱性蛋白酶虽然可以水解蛋白质，却不能作用于淀粉、脂肪等物质^[1]。

图1-1-1 碱性蛋白酶外观

1.2 理化性质

碱性蛋白酶常温下大多为白色粉末，在弱碱性的环境中碱性蛋白酶结构稳定，具有较高活性。碱性蛋白酶是蛋白酶的一类，它能够水解蛋白质的肽键，在pH9～11的范围内保持这较高的活性，它的适宜作用温度在35-50℃；碱性蛋白酶能溶解于大多数洗涤剂中，但是表面活性剂中的阴离子和氧化剂会降低它的活力稳定性，使它在短时间内失活。碱性蛋白酶的分子量基本都在26000-34000，等电点大都在8.0-9.0，其主要作用于肽链，水解肽键生成低分子量的二肽类物质。

不少研究表明，碱性蛋白酶的活力会受到离子的影响：如Ca² 、Mg² 、Mn² 等，能够有效提高它的活力。不仅如此，研究还表明Ca² 可以保护这些蛋白酶在高温下空间结构稳定不易失活。值得一提的是，有些Ca² 的结合位点还能提高碱性蛋白酶的活性及稳定性^[2]。

1.3 生产状况

蛋白酶（protease），能够水解蛋白质肽键的酶，我们把它叫做蛋白酶。作为酶制剂，蛋白酶在工业化的应用中是不可或缺的，蛋白酶的产业总额在酶制剂市场的占有率超过2/3，可以说是酶制剂产业的领头羊，在洗涤、银回收、制皮制革、食品、医药、饲料、化工以及废物处理等行业都有大规模使用。蛋白酶同时还执行着大量不同的生理功能，不管是细胞还是生命个体，它们的生命活动都离不开蛋白酶。可以这么说，有生命的地方，就有蛋白酶。蛋白酶也存在于致病生物体的生活史中，比如细菌、病毒，不过因此它们也可以成为治疗这些疾病的良药，也许在不久的将来，我们可以用蛋白酶去治愈一些令人惧怕的疾病。此外，在很久以前我们的祖先就已经将蛋白酶应用于食品了，而这个历史，远长于蛋白酶的发现史，比如酿造、腌制。在皮革工业中，蛋白酶可以替代有毒的化学药剂来使绵羊脱毛和皮革软化，这同时也是蛋白酶在生物化学方面的应用。蛋白酶制革在目前看来还是相对较新的应用领域，以后的发展完善将会有更多的优势浮现。

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