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摘 要

本文首先对重组人胰岛素的定义以及研究重点，研究状况进行了介绍；并介绍了毕赤酵母发酵体系以及其优势。然后从已经构建好的毕赤酵母主菌种库中扩增一批种子并从细胞形态，细胞存活率，表达量，基因稳定性，非还原电泳检测，一二级生长情况等方面鉴定种子是否优良。从中取优秀的种子进行发酵，通过确定其各个发酵条件诸如温度、ph、溶氧诱导时间及诱导温度等，使其能够高效表达。最后对产物进行蛋白纯化。最终确定毕赤酵母发酵的适宜条件以及后续分离纯化的步骤。

关键词：毕赤酵母 重组人胰岛素 种子鉴定 发酵

Expression And Purification Of Recombinant Human Insulin In Pichia Pastoris

Abstract

In this paper, we first introduce the definition of recombinant human insulin and the research focus, the research status is introduced, and the Bi Chi's yeast fermentation system and its advantages are introduced. Then from has built good yeast Pichia pastoris strain library amplification a batch of seeds and from the cell morphology, cell viability and expression, genetic stability, non reducing electrophoresis detection, the secondary growth identified whether the seed is excellent. From take good seed fermentation, by determining its various fermentation conditions such as temperature, pH, dissolved oxygen induction time and temperature induced, which can efficiently express. Finally, the product was purified by protein. Finally, the suitable conditions for the fermentation of Pichia pastoris and the steps of subsequent separation and purification are finally determined.

Key words: Pichia pastoris;recombinant human insulin;seed identification; fermentation

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1生物技术 1

1.2糖尿病及其治疗药物的现状 1

1.3胰岛素 2

1.3.1胰岛素结构组成 2

1.3.2胰岛素的体内合成 2

1.3.3胰岛素生理作用 2

1.4胰岛素药物研究状况 3

1.4.1胰岛素研发历史 3

1.4.2胰岛素类似物 3

1.5巴斯德毕赤酵母表达系统 4

1.5.1宿主菌 4

1.5.2表达载体 4

1.5.3外源蛋白的高效表达 5

1.6发酵条件的研究 5

1.6.1培养基 5

1.6.2PH值 5

1.6.3温度 6

1.6.4溶氧浓度（DO） 6

1.6.5发酵方式 6

1.4发酵液预处理 7

1.5离子交换色谱 7

第二章 实验器材及试剂 8

2.1主要仪器 8

2.2试剂 9

2.3培养基配置 10

第三章 菌种扩增以及种子鉴定 12

3.1主种子批扩增 12

3.1.1划板 12

3.1.2挑克隆 12

3.1.3转菌 12

3.1.4种子分装保存 12

3.2主种子菌一级二级生长情况鉴定 12

3.2.1培养基配置 12

3.2.2接一级种子菌 13

3.2.3一级种子菌转接二级 13

3.2.4二级种子菌液培养取样记录 13

3.2.5二级种子比生长速率比较 13

3.2.6二级种子生长时间与OD₆₀₀的趋势图 14

3.3细胞形态鉴定 15

3.4筛选标志鉴定 15

3.5基因稳定性鉴定 16

第四章 毕赤酵母发酵条件的优化 17

4.1诱导时间对蛋白表达的影响 17

4.1.1接种 17

4.1.2转菌及诱导 17

4.2PH对菌体生长以及蛋白表达量的影响 18

4.3温度对蛋白表达量的影响 19

4.4培养基中（NH₄）₂SO₄ 浓度的影响 19

4.5诱导时甲醇补加量的影响 20

4.5发酵罐培养 20

第五章 蛋白纯化 21

5.1发酵液预处理 21

5.1.1离心 21

5.1.2上样样品预处理 21

5.2目的蛋白分离 21

5.2.1纯化缓冲液配置 21

5.2.2样品过NuviaS柱 21

第六章 总结 22

致谢 24

参考文献： 25

文献综述

1.1生物技术

生物技术是将基因工程包括蛋白质工程，细胞工程以及发酵工程还有酶工程等作为工具，以生物体为依靠而发展各种与生物相关产业的技术^[1]。生物技术作为一种高新技术，为全球一系列问题带来了解决方案，比如人口膨胀带来的粮食短缺，能源匮乏，环境污染等问题。同时在医疗方面生物技术也起着巨大的作用，基因诊断与治疗，抗体药物的出现等等都是医药生物技术快速发展带给人类的福音。诺贝尔奖获得者Goldstein J B曾经说过：“人类在过去两三百年中的发展我们可以总结为19世纪是工业革命的世纪，其代表为蒸汽机；20世纪是信息技术的时代，其代表为计算机和通讯技术；而到了21世纪，就是生命科学与技术的世纪，以生物制药为代表的世纪”^[2]。

1.2糖尿病及其治疗药物的现状

糖尿病作为一种内分泌代谢类疾病，其引发原因为体内胰岛素相对或绝对不足。糖尿病可以分为两种，胰岛素依赖型糖尿病(IDDM , 1 型)占了大约5%, 1型糖尿病主要是由胰岛β细胞发生异常反应导致体内生产胰岛素的胰腺细胞损坏，可能产生的病因为遗传或者因为自身免疫缺陷导致病毒感染引起；2 型糖尿病与1型糖尿病的区别在于其患者产胰岛素能力并没有完全丧失，由于受遗传、肥胖、年龄及饮食等影响导致体内胰岛素含量降低或者是胰岛素含量正常但是靶细胞对于胰岛素不够敏感导致胰岛素的作用效果受到影响, 使患者体内的胰岛素相对缺乏^[3]。

目前治疗糖尿病的药物种类很多，其中治疗1型糖尿病的特效药物为胰岛素类药物，2型糖尿病的治疗药物除了胰岛素外，主要是口服降糖。

1.3胰岛素

1.3.1胰岛素结构组成

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