论文总字数：19561字

摘 要

原油降解菌是利用微生物将原油降解成对环境无害的物质。利用微生物来解决原油污染问题，是目前公认的低投资，高效益，便于应用的解决方法，因此原油降解菌在抑制环境污染的问题上有很大的应用价值。

本实验采用的是从胜利油田原油污染土壤中发现的一株可降解原油的菌，进行测序得到是革兰氏阳性菌——芽孢杆菌属。在LB培养基中对其生理特性研究得到：菌种在4h后就开始进入对数生长期，12h后生长开始变得缓慢，24h后生长开始变得稳定，在48h后菌种开始进衰败期；菌种生长的最适温度为45℃、最适pH为7.0、最适的盐度为1%,且耐受盐浓度可以达到8%。并且在发酵培养基优化过程中发现：该菌株最佳氮源为硫酸铵，而微量元素的存在更有利于菌株降解原油。对该菌株进行原油降解特性研究中发现：菌种在45℃，150r/min培养3d后，原油的降解率达到85.5%；并对菌株接种量及原油添加量进行优化实验中发现：菌株最优的接种量为2%，最优的原油添加量为3 g/L。对比同时期文献发现：该菌株属于一株中高温菌株且降解率高，对外源菌株应用到油藏开采的具有很大的研究意义。

关键词：芽孢杆属 降解菌 原油降解 生理特性

Isolation,Identification and Degradation Characteristics of a Crude Oil - degrading Bacteria

ABSTRACT

Crude oil degrading bacteria is a kind of microorganism that could be used to degrade crude oil into environmentally friendly substances, and it has magnificent application value for it’s low-investment, high-efficiency, and easy-applying in the suppression of environmental pollution.

The crude oil degrading bacteria used in this experiment is founded in crude oil contaminated soil taken from Shengli Oilfield, which then be sequenced as Gram-positive bacteria ,Bacillus genus.The physiological characteristics of the strain fermented in LB medium we found is: 4h to the logarithmic growth phase, 12h to the slow-growth phase, 24h to the stable phase, and 48h to the declining phase.The optimal fermentation condition is 45℃，PH 7.0 and salinity 1% ，while the salt tolerance could reach 8%. The best nitrogen source is urea，and taking trace elements in can make the degrading better。In the research of crude oil degradation characteristics， we found that the degradation rate could reach 85.5% after 3d in 150℃，150 r / min. The inoculation amount is 2%，and the optimal amount of crude oil added is 3 g / L。Comparing with the same period of literature，we found that the strain belongs to a medium-high temperature strain with high degradation rate, and it has great significance for the application of using exogenous strains into the reservoir exploitation.

keywords: Bacillus sp. ；Degrading bacteria；Crude oil degradation；

PHysiological characteristics

目录

摘要 II

ABSTRACT III

第一章 文献综述 1

1.1原油降解菌出现的背景 1

1.2原油降解方法及微生物降解原理 1

1.2.1原油降解方法 1

1.2.2微生物降解原理 1

1.3原油降解菌 2

1.3.1目前已知的原油降解菌 2

1.3.2目前国内外对原油降解菌的研究情况 2

1.4枯草芽孢杆菌 2

1.4.1枯草芽孢杆菌的基本性质 2

1.4.2枯草芽孢杆菌的应用价值 3

1.5影响降解的因素 3

1.6对原油降解率的测定方法 3

1.6.1 重量法 3

1.6.2紫外分光光度法 3

1.6.3 气相色谱法 4

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1 菌株来源 5

2.1.2实验仪器 5

2.1.3实验试剂 5

2.1.4培养基 6

2.1.5培养基与器材灭菌方法 6

2.2实验方法 7

2.2.1 目标菌株的活化与接种 7

2.2.2 目标菌株的鉴定 7

2.2.3 菌株的保存 7

2.2.4 菌株的生长特性 8

2.2.5 菌株的降解特性 8

第三章 结果与讨论 10

3.1 菌株的鉴定 10

3.1.1 镜检 10

3.1.2 16SrDNA测序技术 10

3.2菌株的生理特性 11

3.2.1菌株的生长曲线 11

3.2.2最适温度 13

3.3.3最适PH 13

3.3.4最适耐盐量 14

3.3菌株的降解特性 14

3.3.1 原油降解率的测定 14

3.3.2 氮源的优化结果 16

3.3.3 微量元素的优化结果 17

3.3.4 原油添加量优化 18

3.3.5 接种量优化 19

第四章 结论与展望 21

4.1结论 21

4.2展望 21

参考文献 23

致谢 26

第一章 文献综述

1.1原油降解菌出现的背景

自1993年起，我国从石油的出口国变成了进口国，随着社会的经济发展，我国对于石油的需求变得越来越大，我国渐渐地开始超越美国，成为了对于石油的最大的进口国。自从石油化工开始崛起，石油化学制品就成为了社会发展必不可少的能源^[1]。原油是一种从油井中开采出来的未加工的石油，原油中含有其他的烃类化合物和一些微量元素，在加工后或长时间暴露在空气中，会对我们人体有危害，并且会污染空气，水资源等，^.由于原油存在的污染性，世界各国开始研究开发治理污染技术。

1.2原油降解方法及微生物降解原理

1.2.1原油降解方法

目前所已知的方来降解原油：物理方法，化学方法，生物方法^[2]。物理方法，主要是利用热处理法，通过将土壤进行焚烧，土壤中的大部分的有机污染物会通过焚烧降解，但是热处理法会破坏土壤性能，焚烧后产生的气体会污染大气。利用化学方法来降解原油，主要是利用化学试剂对原油污染的土壤来进行水洗，但是利用化学试剂来降解原油，存在的最大的问题就是化学试剂会对土壤产生污染，造成的二次污染很难再次清理干净，有可能让土壤产生毒性。目前世界上公认的比较好的降解原油的方法就是利用微生物来降解原油^[3]。

1.2.2微生物降解原理

原油降解菌降解原油是生物修复法的一种。生物修复技术利用动物、植物和微生物的吸收、降解、转化土壤或水中的微生物，达到降解的目的^[4]。用微生物来降解原油的原理是：利用微生物的降解作用，将原油之中含有的烷烃类物质分解成对环境无害的物质，避免二次污染，

1.3原油降解菌

1.3.1目前已知的原油降解菌

目前已知的降解石油烃的微生物共有70属200余种^[5]。能够降解石油烃的细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、不动杆菌属（Acinetobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、气单胞杆菌属（Aeromonas）、无色杆菌属（Achromobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、肠杆菌属（Enterobacterianceae）、棒杆菌属（Coryhebacterium）、节杆菌属（Arthrobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、葡萄球菌属（StapHylococcus）、微球菌属（Micrococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）等；酵母菌有假丝酵母属（Candida）、红酵母菌属（Rhodotorula）、毕赤氏酵母菌属(Pichia)等；霉菌有青霉菌（Penicillium）、曲霉菌（Apergillus）、链孢霉属（Fusarium）等^[6]。

1.3.2目前国内外对原油降解菌的研究情况

目前对于原油降解菌的研究，国内外的学者已经进行了大量的实验室实验以及油井实验。国外的主要研究的是原油降解菌的降解率，以及原油降解菌的降解机理。国内主要研究原油降解菌的筛选以及所筛选的原油降解菌的降解率，并尝试利用其来进行模拟修复土壤。

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