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摘 要

琥珀酸是重要的碳四平台化合物，利用生物法替代石化法合成琥珀酸是大势所趋。由于大肠杆菌不能耐受酸性环境，发酵过程需控制pH值在7.0左右，导致发酵与产物提取过程需引入大量的碱与酸，大大增加了原料成本。因此研究如何增强生产菌株对低pH的耐受能力是提升生物法琥珀酸生产技术的重要前提。

本论文在前期构建的产琥珀酸大肠杆菌Suc260的基础上，将铜绿假单胞菌中合成反式不饱和脂肪酸的顺反异构酶Cti 连接到大肠杆菌表达型质粒 pTrc99a 中，并在Suc260 中表达，得到重组菌株Suc260/pTrc99a-cti。分别考察原始菌株和重组菌株在低pH条件下细胞生长和产酸性能。厌氧发酵结果表明，出发菌株在碱式碳酸镁调节pH血清瓶发酵中Suc260的最大OD₅₅₀为8.54，琥珀酸的产量和收率分别为25.1 g/L和0.80 g/g；重组菌株Suc260/pTrc99a-cti的最大OD₅₅₀为10.21，琥珀酸的产量和收率分别为27.2g/L和0.84g/g。在磷酸缓冲液调节pH条件下，重组菌株Suc260/pTrc99a-cti的最大OD₅₅₀为2.71，比原始菌株提高了1.68倍。在pH6.0的发酵罐发酵中，重组菌株的琥珀酸浓度和收率为45.08 g/L、0.81g/g，分别比出发菌株提高了1.25倍和1.33倍。这些结果表明，增加细胞膜中反式不饱和脂肪酸含量有助于提高大肠杆菌对低pH的耐受性能。

关键词：琥珀酸 大肠杆菌 低pH 细胞膜组分

ABSTRACT

Succinic acid is an important carbon tetra-platform compound. The use of biological methods to replace the petrochemical synthesis of succinic acid is a general trend. Because E. coli can not tolerate the acidic environment, the pH value of the fermentation process needs to be controlled at about 7.0, which leads to the introduction of a large amount of alkali and acid in the fermentation and product extraction process, which greatly increases the cost of raw materials. Therefore, research on how to enhance the tolerance of the production strains to low pH is an important prerequisite for improving the biological succinic acid production technology.

In this dissertation, based on the succinic acid producing succinate Suc260 constructed in the previous stage, the cis-trans-isomerase Cti for synthesizing trans-unsaturated fatty acids in Pseudomonas aeruginosa was linked to the E. coli expression plasmid pTrc99a, and in Suc260 Expression, recombinant strain Suc260/pTrc99a-cti was obtained. The cell growth and acid production performance of the original and recombinant strains at low pH were investigated. The results of anaerobic fermentation showed that the maximum OD₅₅₀ of Suc260 was 8.54, the yield and yield of succinic acid were 25.1g/L and 0.80g/g, respectively; the recombinant strain Suc260/pTrc99a. The maximum OD₅₅₀ of -cti was 10.21, and the yield and yield of succinic acid were 27.2g/L and 0.84g/g, respectively. The maximum OD₅₅₀ of the recombinant strain Suc260/pTrc99a-cti was 2.71, which was 1.68 times higher than that of the original strain. In the fermentor fermentation at pH 6.0, the succinic acid concentration and yield of the recombinant strain were 45.08g/L and 0.81g/g, respectively, 1.25 times and 1.33 times higher than the original strain. These results indicate that increasing the trans-unsaturated fatty acid content in the cell membrane helps to increase the tolerance of E. coli to low pH.

Key word: Succinic acid E. coli Low pH Cell membrane components

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1琥珀酸简介 1

1.2pH对生物生长代谢的影响 3

1.3本论文的研究意义与内容 4

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1 实验菌种 5

2.1.2 培养基 5

2.1.3 实验器材 6

2.2实验方法 7

2.2.1过量表达cti重组菌Suc260的构建及鉴定 7

2.2.2菌株的活化 9

2.2.3试管摇瓶种子培养 9

2.2.4血清瓶厌氧发酵 9

2.2.5发酵罐培养方法 9

2.3检测分析方法 9

2.3.1细胞培养方法 9

2.3.2检测方法 9

第三章 结果与讨论 11

3.1过量表达cti重组菌的构建及鉴定 11

3.2碱式碳酸镁调节PH的血清瓶厌氧发酵 13

3.3磷酸缓冲液调节PH的血清瓶厌氧发酵 14

3.4Suc260和Suc260/pTrc99a-cti菌5L发酵罐厌氧发酵 14

第四章 结论 17

4.1 结论 17

4.2 不足与展望 17

参考文献 19

致谢 22

第一章 文献综述

1.1琥珀酸简介

琥珀酸又称丁二酸，是三羧酸循环(TCA)的中间产物，同时也是厌氧代谢的发酵产物之一^[1]。琥珀酸天然来源是松属植物的树脂久埋于地下而成的琥珀等，此外还广泛存在于多种植物、动物的组织中。伴随着人口爆发性的增长和发展中国家工业化的脚步也越来越快我们对于能源的匮乏问题越来越多，我们迫切寻找到别的代替方法。由于化石资源储量有限，且极易引起大气污染等环境问题 ^[1] ，使得以可再生的生物质资源替代不可再生的化石资源，以清洁、高效的生物炼制加工方式替代污染、低效的传统资源加工方式，是转变经济增长模式、保障社会经济可持续发展的重大战略需求。微生物发酵技术制备生物基化学品和生物燃料在最近受了广泛关注^{[2, 3]} 。琥珀酸是一类重要的碳四平台化合物，广泛应用于精细化工产品和可生物降解的聚合物前体，应用前景十分广阔。广泛运用于医药、材料、食品、油漆、农业、纺织等领域，因此在工业上有十分重要的用途，也被有关部门评定为将来极有价值的生物炼制产品之一。传统法合成琥珀酸主要以石油为原料，从丁烷通过顺丁烯二酸酐进行生产，但石油资源稀缺、生产成本高、生产工艺复杂、产率和纯度不高，并且伴随着严重的环境污染，限制了其在工业上大规模发展的潜力。生物法合成琥珀酸是以可再生资源为原料^[4,5,6]，经过微生物自身代谢发酵制备而成，具有成本低、污染小、环境友好等优势。在实验室中，琥珀酸可用两分子丙二酸二乙酯的钠盐与碘反应，继而水解脱羧制得。琥珀酸的重要用途是制备五元杂环化合物，例如，琥珀酸受热迅速失水，形成琥珀酸酐，它是呋喃环系化合物。琥珀酸酐是制造药物、染料和醇酸树脂的重要原料。琥珀酸酐与氨共热，即生成丁二酰亚胺。丁二酰亚胺的亚胺基上的氢可被溴取代，生成N－溴代丁二酰亚胺,它是有机合成的溴化试剂和温和的氧化剂。另外，琥珀酸还可用来合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸酯(PBS)和聚酰胺，这使琥珀酸的市场需求量高达 2.7×10 7 t/a^[7]。

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