论文总字数：22393字

摘 要

甲醇是煤化工产业的重要产品，其具有来源丰富，价格低廉，含能高等优势。因此，如果能够在生物制造时用甲醇来替代目前的粮食这一原料，不仅有助于解决粮食问题，而且可以在相当程度上减少生产的成本，从而提高我国生物基产品的竞争力，实现可持续发展。然而，目前较低的甲醇耐受性是影响甲醇高效生物转化的重要因素之一。

本论文通过自然选育的方法，从污泥中筛选获得了一株能以甲醇作为唯一碳源和能源的甲基营养菌。甲醇耐受性实验结果表明，该菌株可耐受高达50 g/L的甲醇。通过16sDNA对其进行种属鉴定，确定其属于Methylomonas sp。为进一步考察其生理代谢性能，研究了不同温度和不同pH对其细胞生长和甲醇利用性能的影响。结果表明该菌株的最适生长pH为6，最适生长温度为30℃；在最适条件下，48 h后，最大OD₆₀₀可达7.6。本研究为甲醇的高效生物转化奠定了基础，为非甲基营养菌的构建提供了基因来源。

关键词：甲醇 甲基营养菌 甲醇耐受性 菌株筛选

ABSTRACT

Methanol is an important product of the coal chemical industry. It has the advantages of abundant sources, low prices, and high energy content. Therefore, if methanol can be used as a substitute for the current foodstuff in the bio-manufacturing process, it will not only help solve the food problem, but also can reduce the production cost to a considerable extent, thereby increasing the competitiveness of China's bio-based products and achieving Continuous development. However, the current low methanol tolerance is one of the important factors affecting the efficient biotransformation of methanol.

In this dissertation, natural breeding methods were used to select a strain of methylotrophic bacteria that could use methanol as the only carbon source and energy source. The results of the methanol tolerance test showed that the strain can tolerate up to 50 g/L of methanol. The species was identified by 16sDNA and it was determined to belong to Methylomonas sp. To further investigate its physiological metabolism, the effects of different temperatures and different pH on cell growth and methanol utilization performance were studied. The results showed that the optimum growth pH of the strain was 6 and the optimum growth temperature was 30°C. Under the optimal conditions, the maximum OD600 reached 7.6 after 48 hours. This study laid the foundation for the efficient biotransformation of methanol and provided a genetic source for the construction of non-methylotrophic bacteria.

Key word: Methanol ; Methylotroph ; Methanol tolerance ; Strain screening

目录

摘要 2

ABSTRACT 3

目录 4

第一章 文献综述 5

1.1甲醇简介 5

1.2甲基营养菌的研究与应用简介 5

1.3菌株的筛选原理 7

1.4本论文的研究意义与内容 8

第二章 材料与方法 10

2.1实验材料 10

2.1.1 实验试剂 10

2.1.2 实验器材 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 污泥的采集与预处理 11

2.2.2 菌株的筛选与分离 11

2.2.3 菌株的纯化 11

2.2.4 分子鉴定 12

2.2.5 甲醇浓度的优化及生理特性研究 15

第三章 结果与讨论 17

3.1 菌株筛选结果 17

3.2 菌株纯化结果 18

3.3分子鉴定结果 20

3.3.1提取基因组结果 20

3.3.2 琼脂糖凝胶电泳结果 20

3.3.3 16sDNA鉴定结果 21

3.4 甲醇浓度的优化及生理特性研究 22

3.4.1 不同甲醇浓度下的OD₆₀₀值 22

3.4.2 不同pH下的OD₆₀₀值 23

3.4.3 不同温度下的OD₆₀₀值 24

第四章 结论 25

4.1 结论 25

4.2 展望 25

参考文献 26

致谢 32

第一章 文献综述

1.1甲醇简介

甲醇是一种易挥发、有毒性的透明液体，在所有饱和一元醇中，具有最简单的结构。甲醇作为基础的有机化工原料和燃料，具有极为广泛的应用。甲醇作为生产原料，可生产多种下游产品如甲醛、甲氨、醋酸等。这些产品又可被用于精细化工和塑料生产。除此之外，甲醇也常用于农药和医药的生产。甲醇作为煤化工产业的重要产品，具有以下优势：1. 广泛的原料来源，无论是从天然气中或是工业废气中的二氧化碳中，都可以合成甲醇。此外，通过煤炭以及可再生的生物质等途径也能合成甲醇； 2. 相对较低的价格，目前，甲醇的市价仅为葡萄糖的1/3 ；3. 高含能，能供给足够的还原力用以所需产物的合成。因此，如果能够在生物制造时用甲醇来替代目前的粮食这一原料，不仅有助于解决粮食问题，还能够在很大程度上降低生产成本，进一步的增强生物基产品的竞争力，从而实现可持续发展。

1.2甲基营养菌的研究与应用简介

甲基营养菌是一种能够利用碳一化合物（C1），如甲醇，作为其唯一的碳源和能源的微生物。它们有一个共同的初始氧化步骤：将甲醇氧化为甲醛，随后通过各种途径产生能量和生物质[2,3]。与常用的原料糖蜜相比，甲醇是一种更为纯净的原料，且价格相对便宜，也是一种可以通过甲烷生产得到的可再生碳源[5]。近年来，甲基营养菌的研究逐渐深入，人们也愈发意识到它在生物技术领域的巨大潜力。如甲醇芽孢杆菌，这是一种革兰氏阳性细菌，能够在高达60℃的温度下利用甲醇进行生长，且最适生长温度为50-53℃[6]。这一特性使得它在工业催化领域具有广阔前景。又如毕赤酵母，该菌的菌株能够自然产生和分泌大量的L-谷氨酸[7]，并且研究人员已经通过甲基磺酸乙酯诱变的方法获得了能够过量产生L-赖氨酸的工程菌株[6]。另外，该工程菌株已经被用于代谢工程的转化方

法和表达质粒的研究[8-10]。

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