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摘 要

L-鸟氨酸是一种重要的化工原料和医药中间体，在生物体的代谢中参与了尿素循环，可以帮助排出人体内代谢产生的氨态氮，具有一定解毒作用。本文将在实验室已有的碳源为葡萄糖的高产L-鸟氨酸谷氨酸棒杆菌CGMCC 1006（Corynbacterium glutamicum）中引入甲醇的利用途径，以达到利用混合碳源生产L-鸟氨酸的目的。为了提高谷氨酸棒杆菌利用不同碳源的效率，本文将以实验室已有高产L-鸟氨酸的菌株C. glutamicum为出发菌株，通过分子生物学的方法，以pXMJ19为载体，将mdh、hps、phi连接在pXMJ19，通过电转化将其转化至C. glutamicum中，使C. glutamicum具有部分代谢甲醇的能力。比较在以葡萄糖、葡萄糖-甲醇混合作为碳源的情况下，菌株的生长及发酵情况。同时比较改造后的重组C. glutamicum分别在葡萄糖、葡萄糖 甲醇、果糖、木糖作为碳源的情况下的生长代谢情况以及发酵产量。通过对不同碳源下的谷氨酸棒杆菌的发酵进行比较，得出菌株在生长、碳源消耗、L-鸟氨酸产量等方面的比较，进一步对谷氨酸棒杆菌利用不同碳源生产L-鸟氨酸的性能进行验证。改造后的菌株在利用果糖作为单一碳源时生长最好，菌体干重达到了1.5 g/L，而以木糖为碳源时，菌体几乎不生长。在以果糖为碳源发酵时，L-鸟氨酸产量可达3.27 g/L。

关键词：谷氨酸棒杆菌 混合碳源 L-鸟氨酸 甲醇代谢体系

Comparative Study on Growth and Synthesis of L-ornithine by Corynebacterium glutamicum Using Different Carbon Sources

Abstract

1. ornithine is an important chemical raw material and pharmaceutical intermediate. It participates in the urea cycle in the metabolism of organisms.And it has a certain detoxification effect, which can help discharge the ammonia nitrogen produced by metabolism in the human body. In this article, we will try to make Corynebacterium glutamicum CGMCC 1006 grow with methanol to achieve the purpose of producing L-ornithine using a mixed carbon source. In order to improve the efficiency of different carbon sources of C. glutamicum, this paper will construct mdh, hps and phi on pXMJ19 by molecular biology method using pXMJ19 as carrier. We converted pXMJ19 to C. glutamicum by electroporation, allowing C. glutamicum to metabolize methanol. We will compare the growth and fermentation of the strain with glucose and glucose-methanol mixed as a carbon source. At the same time, we compared the growth and the fermentation yieldof recombinant C. glutamicum with fructose and xylose as carbon sources. By comparing the growth performance of C. glutamicum under different carbon sources, we obtained a comparison of the growth of the strain, the consumption of carbon source and the production performance of L-ornithine fermentation. We validated the performance of C. glutamicum using different carbon sources to produce L-ornithine. The modified strain showed the best growth when fructose was the sole carbon source. The dry weight of the bacteria reached 1.5g/L, and the L-ornithine yield reached 3.27 g/L. When xylose is used as a carbon source, the cells hardly grow.

Key Words：Corynebacterium glutamicum；mixed carbon source；L-ornithine；Methanol metabolism system

目 录

摘 要 2

Abstract 3

第一章 文献综述 6

1.1 甲醇概述 6

1.1.1 甲醇在微生物领域的应用 6

1.1.2 甲基营养菌的研究进展 6

1.1.3 甲醇的代谢过程 7

1.2 L-鸟氨酸概述 8

1.2.1 L-鸟氨酸的性质 8

1.2.2 L-鸟氨酸的应用 8

1.2.3 L-鸟氨酸的制备方法 9

1.3 谷氨酸棒杆菌概述 11

1.3.1 碳源选择 11

1.3.2 谷氨酸棒杆菌的发酵及应用 12

1.4 研究内容 12

第二章 实验材料和方法 13

2.1 实验材料 13

2.1.1 实验仪器及器材 13

2.1.2 菌株、质粒、分子试剂 15

2.2 配置培养基 16

2.2.1 配置LB 16

2.2.2 配置种子液、发酵液和茚三酮反应液 17

2.3 实验方法及步骤 18

2.3.1 活化大肠杆菌DH5α 18

2.3.2 提取pET-duet质粒 18

2.3.3 扩增mdh 18

2.3.4 构建重组质粒 19

2.3.5 制备谷氨酸棒杆菌感受态 21

2.3.6 菌株的多种碳源利用比较 21

2.3.8 相关数据测定 22

2.3.9 测定发酵生成的L-鸟氨酸 22

第三章 实验结论与分析 23

3.1 pET-duet质粒的提取 23

3.2 PCR结果图 23

3.3 重组质粒提取和酶切结果 24

3.4 质粒与目的基因连接结果验证 25

3.5 原培养条件下原始菌株与重组菌株生长对比 25

3.6 甲醇添加量对重组菌生长和L-鸟氨酸产量的影响 26

3.7 重组菌与原始菌株发酵产L-鸟氨酸对比 27

3.8 谷氨酸棒杆菌利用不同碳源生长情况 28

3.9 L-鸟氨酸发酵情况 28

第四章 结论与展望 30

参考文献 31

致 谢 34

第一章 文献综述

1.1 甲醇概述

1.1.1 甲醇在微生物领域的应用

随着工业技术不断发展，由于不可再生的化石能源越来越少，人类不得不正视资源紧缺这一严峻的问题。甲醇作为一种重要的、可再生的清洁能源，近年来在生物化工领域的运用逐渐增多。某些微生物可以将甲醇转换成一些在行业中更常见的能源来完成其自身的生长和代谢活性，从而产生发酵甲醇作为碳和能量的来源。在实验室一般的微生物的生长和代谢过程中，葡萄糖是我们最常用的主要碳源，所以发酵过程通常与使用大量的葡萄糖是不可分割的。葡萄糖在工业上主要以大米、玉米等淀粉含量较高的物质为原料，通过一系列复杂的加工进行生产而成。葡萄糖不仅生产过程较为复杂，而且其生产原材料在食品领域也存在着极大的作用。因此，为了解决资源短缺的问题，在工业发酵过程中寻找其他更加廉价易得的碳源替代品刻不容缓。与葡萄糖相比，甲醇生产所需的原材料为农产品生产加工后剩余的废料或是其他废弃的生物质材料，价格低廉且数量巨大，可实现废弃资源的利用。随着工业技术的不断发展，很多国内外的实验室对菌种进行了分子改造，使得某些微生物可以在利用葡萄糖作为碳源的同时，使用甲醇作为辅助碳源供微生物进行生长代谢，甲醇作为微生物碳源正越来越多地参与到微生物的生产发酵中去。

1.1.2 甲基营养菌的研究进展

甲基营养菌是一种革兰氏阴性菌，能够以没有碳碳单键的单碳化合物或者多碳化合物（如甲醇等）为碳源和能源进行生产代谢发酵，大多为好氧菌。不同类型的甲基细菌有培养后不同菌落形态，它们需要使用甲醇作为碳源和能量来源时，第一要氧化甲醇成甲醛。甲基营养菌可以被分为如下两大类：

（1）甲烷利用菌

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