论文总字数：25469字

摘 要

5-酮基-D-葡萄糖酸（5-keto-gluconic acid，5-KGA）是D-葡萄糖酸5位脱氢的产物。它是一种重要的前体物，可用于合成L-抗坏血酸、4-羟基-5-甲基-2，3-二氢呋喃酮、木糖酸以及L（ ）-酒石酸等物质。5-KGA在微生物体内能够作为储能物质参与能量代谢，在该代谢过程中，D-葡萄糖酸和5-KGA能够通过NADP 依赖的5-葡萄糖酸脱氢酶（Ga5DH）的催化而互相转化，以适应不同的体外环境。

目前5-KGA的主要生产方式是氧化葡萄糖杆菌的全细胞催化，该生产方式存在代谢途径复杂、副产物多、发酵时间长等诸多制约因素。因此我们决定探索Ga5DH胞外催化合成5-KGA的可能性。同时，除了合成5-KGA之外，Ga5DH还能在各种反应中起到提供NADPH还原力的作用，在医疗、制药、生物工程、生物电池等领域都具有广泛的应用前景。

本实验选取氧化葡萄糖杆菌编码的Ga5DH基因，将其导入质粒pET-28a并转化至大肠杆菌中生产Ga5DH，并通过破碎，离心，硫铵沉淀，Ni柱纯化，脱盐浓缩获得Ga5DH纯酶液并进行酶学性质研究。经研究发现：Ga5DH最适pH为10.5，最适反应温度为55℃。Ga5DH对D-葡萄糖酸的V_max值为45.74μmol/（mg*min）、K_m值为1.07mM，对NADP 的V_max值为38.60μmol/（mg*min）、K_m值为21.50mM。通过金属离子测试则发现大部分金属离子对Ga5DH的活性影响小，仅Fe² 和Fe³ 对Ga5DH的酶活表现出了一定的抑制作用。而使用EDTA处理过的Ga5DH酶液仍能保留95%的酶活，由此推测大部分金属离子不参与Ga5DH的催化过程。对Ga5DH的酶学性质研究能够对Ga5DH胞外催化生产5-KGA的可行性和反应条件优化提供一定的参考与帮助。

关键词：5-葡萄糖酸脱氢酶 5-酮基-D-葡萄糖酸 酶学性质 氧化葡萄糖杆菌

Cloning, expression and enzymatic properties of

5-gluconate dehydrogenase

Abstract

5-keto-gluconic acid (5-KGA) is the product of 5-dehydrogenation of D-gluconic acid. 5-KGA is involved in energy metabolism as an energy storage substance in microorganisms.During this metabolic process, D-gluconic acid and 5-KGA can be converted into each other by the catalysis of a NADP -dependent 5-gluconate dehydrogenase (Ga5DH) to adapt to different in vitro environments.

At present, the main production mode of 5-KGA is the whole-cell catalysis of Gluconobacter oxydans. This production method has many restrictive factors such as complicated metabolic pathway, many by-products and long fermentation time.

In this experiment,we selected the Ga5DH gene encoded by Gluconobacter oxydans, introduced it into pET-28a and transformed into E.coli to produce Ga5DH, and was purified by crushing, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, Ni column purification, desalting and concentration to obtain Ga5DH pure enzyme solution. Enzymatic properties studies shows the optimum pH of Ga5DH is 10.5, and the optimum reaction temperature is 55℃. The V_max value of Ga5DH to D-gluconic acid was 45.74μmol/（mg*min）, the Km value was 1.07mM, the V_max value for NADP was 38.60μmol/（mg*min）, and the K_m value was 21.50mM. It was found by metal ion test that most of the metal ions had little effect on the activity of Ga5DH, and only Fe³ and Fe² showed some inhibition on the enzyme activity of Ga5DH. The EDTA-treated Ga5DH enzyme solution still retains 95% of the enzyme activity, and it is speculated that most of the metal ions do not participate in the catalytic process of Ga5DH. The study of the enzymatic properties of Ga5DH can provide some reference for the feasibility of G5DH extracellular catalytic production of 5-KGA and optimization of reaction conditions.

Key words: 5-gluconate acid dehydrogenase 5-keto-D-gluconic acid Enzymatic Properties Gluconobacter oxydans

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 5-酮基-D-葡萄糖酸概述 1

1.1.1 5-酮基-D-葡萄糖酸简介 1

1.1.2 5-酮基-D-葡萄糖酸的研究进展 1

1.2 5-葡萄糖酸脱氢酶概述 2

1.2.1 5-葡萄糖酸脱氢酶简介 2

1.2.2 5-葡萄糖酸脱氢酶的催化机制 3

1.2.3 对Ga5DH基因表达的研究 3

1.2.4 5-葡萄糖酸脱氢酶的其他作用 4

1.3 本研究的意义和主要研究方法 4

第二章 5-葡萄糖酸脱氢酶的克隆与表达 6

2.1 前言 6

2.2 材料 7

2.2.1 菌种和质粒 7

2.2.2 培养基 7

2.2.3 菌种的培养方法 7

2.2.4 工具酶 8

2.2.5 试剂 8

2.2.6 试剂配制 9

2.2.7 仪器与设备 9

2.3 方法 10

2.3.1 Ga5DH的引物设计 10

2.3.2 氧化葡萄糖杆菌的活化 10

2.3.3 目标基因的PCR扩增与验证 11

2.3.4 质粒的抽提与验证 11

2.3.5 酶切反应 12

2.3.6 连接反应 12

2.3.7 感受态细胞的制备 12

2.3.8 重组质粒导入感受态细胞 13

2.3.9 重组菌的筛选与验证 13

2.3.10 Ga5DH表达的验证与酶活的测定 13

2.4 结果与讨论 14

2.4.1 表达载体构建验证 14

2.4.2 菌落PCR 14

2.4.3 Ga5DH表达的验证与酶活的测定 15

2.5 小结 16

第三章 Ga5DH的纯化与酶学性质研究 17

3.1 前言 17

3.2 材料 17

3.2.1 试剂 17

3.2.2 试剂配制 18

3.2.3 仪器与设备 18

3.3 Ga5DH的纯化 18

3.3.1 细胞破碎 18

3.3.2 硫铵沉淀 19

3.3.3 Ni² 离子亲和层析 19

3.3.4 脱盐与浓缩 19

3.4 Ga5DH的酶学性质研究 19

3.4.1 纯酶液的蛋白浓度以及酶活测定 19

3.4.2 pH对Ga5DH的影响 19

3.4.3 温度对Ga5DH的影响 20

3.4.4 金属离子对Ga5DH的影响 20

3.4.5 Ga5DH的酶动力学测定 20

3.5 结果与讨论 21

3.5.1 蛋白纯化验证与纯酶酶活测定 21

3.5.2 pH对Ga5DH的影响 22

3.5.3 温度对Ga5DH的影响 23

3.5.4 金属离子对Ga5DH的影响 24

3.5.5 Ga5DH的酶动力学测定 25

3.6 小结 26

第四章 总结与展望 28

4.1 总结 28

4.2 展望 29

参考文献 30

致 谢 33

请支付后下载全文，论文总字数：25469字