论文总字数：28080字

摘 要

对能源和环境问题的关注推动了生产脂类生物燃料等可再生液体燃料的研究。产油酵母具有积累高脂质含量的能力，这为生物燃料和工业油脂化学品的可持续生产提供了一个特别有吸引力的平台。尤其是, 来自可再生原料的微生物油脂三酰甘油 (TAG) 引起了人们的极大关注, 因为TAG可以直接用于生物柴油和其他重要油脂化学品的生产。解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica) 是一种典型的产油酵母，具有高乙酰CoA通量和高三羧酸循环通量。解脂耶氏酵母作为 FDA 认定的安全微生物, 其脂质代谢途径已经得到了广泛的研究，它拥有大量的基因工程工具，且基因组已经被完全测序。这些特性使得解脂耶氏酵母成为生产基于脂质的生物燃料和油脂化学品的优越工业宿主。这篇论文总结了解脂耶氏酵母积累油脂的研究进展。首先介绍了解脂耶氏酵母的油脂合成和降解途径及其与代谢工程的关系。然后重点介绍了利用代谢工程提高解脂耶氏酵母油脂积累的策略。最后，对解脂耶氏酵母未来的工业应用前景进行了展望。

关键词：三酰甘油；微生物油脂；解脂耶氏酵母；代谢工程；生物柴油

Metabolic engineering for increasing lipid accumulation in Yarrowia lipolytica

Abstract

The focus on energy and environmental issues has driven research into the production of renewable liquid fuels such as lipid biofuels. Oleaginous yeasts provide a particularly attractive platform for the sustainable production of biofuels and industrial chemicals due to their ability to accumulate high amounts of lipids. In particular, microbial lipids in the form of triacylglycerides (TAGs) produced from renewable feedstocks have attracted considerable attention because they can be directly used in the production of biodiesel and oleochemicals analogous to petrochemicals. Yarrowia lipolytica is a safe microorganism recognized by the FDA. Its lipid metabolism pathway has been extensively studied. It has a large number of genetic engineering tools and the genome has been completely sequenced. These characteristics make Y. lipolytica a remarkable industrial host for the production of lipid-derived biodiesel and oleochemicals. In this review, we highlight the newest strategies for increasing lipid accumulation using metabolic engineering and summarize the research advances on the overaccumulation of lipids in Y. lipolytica. Finally, perspectives for future engineering approaches are proposed.

Keywords: Yarrowia lipolytica, Metabolic engineering, Lipid accumulation, Triacylglycerides, Biodiesel

目录

摘要 I

Abstract II

目录 I

第一章 绪论 3

1.1 产油微生物简介 3

1.2 解脂耶氏酵母简介 3

1.3解脂耶氏酵母油脂积累和降解途径 4

1.4 课题研究意义和研究内容 9

1.4.1课题研究意义 9

1.4.2本课题研究内容 9

第二章 提高解脂耶氏酵母油脂积累的代谢工程策略 10

2.1 经典的代谢工程策略 10

2.1.1调控油脂代谢关键基因的表达 10

2.1.2调控细胞代谢调控因子的活性 11

2.1.3异源表达功能性的基因 11

2.1.4扩展可利用底物的范围 12

2.2 新颖的代谢工程策略 13

2.2.1设计替代的乙酰CoA途径 14

2.2.2设计替代的NADPH途径 14

2.2.3设计氧化还原应激防御途径 15

2.2.4设计分泌油脂到胞外的途径 16

2.2.5适应性进化策略 16

2.2.6计算机辅助的代谢工程 17

第三章 结论与展望 20

3.1结论 20

3.2展望 20

参考文献 22

致谢 25

第一章 绪论

1.1 产油微生物简介

产油微生物是指自身能够合成的油脂含量超过其细胞干重的20%的微生物[1]。这些合成的油脂称为微生物油脂, 又称单细胞油脂, 主要以脂滴的形式存在于产油微生物的细胞器中[2]。产油微生物包括细菌、真菌、酵母和微藻。其中产油酵母是研究最多的, 因为它们生长速度快, 能快速达到高生物量, 这对于快速生产大量的油脂是至关重要的。自然界中存在包括Rhodosporidium, Lipomyces, Candida, Yarrowia属在内的多种产油酵母[3-5]。不同产油酵母体内油脂含量存在较大的差异。例如, 环状红孢子菌 (Rhodosporidium toruloides) 可以自然地积累细胞中70%的油脂含量, 解脂耶氏酵母 (Yarrowia lipolytica) 在自然情况下通常可以积累20-40%的油脂含量[6]。合成的微生物油脂包括中性脂质, 如三酰甘油 (TAG), 硬脂酸酯和游离脂肪酸 (FFA), 还包括非中性脂质, 这些脂质作为细胞的能量储备。中性脂质的组成因微生物而异, 但大多数由三酰甘油组成。通常在产油酵母中, 油脂主要以三酰甘油的形式储存在称为脂质体 (LB) 的特殊细胞器中。

1.2 解脂耶氏酵母简介

解脂耶氏酵母 (Y. lipolytica) 属于半子囊菌纲、耶氏酵母属, 是一种典型的非常规产油酵母。解脂耶氏酵母作为 FDA 认定的安全微生物, 已被广泛认为是生产基于脂质的生物燃料和油脂化学品的优越工业宿主[7]。引起这种油性表型的关键代谢特征包括：高乙酰CoA通量、高三羧酸 (TCA) 循环通量和缺乏发酵能力[8]。此外, 解脂耶氏酵母具有利用各种蛋白质和疏水性底物的能力, 这些底物可以由廉价的可再生碳源提供, 并且可以在很广的pH范围和盐度条件下生长[9, 10]。相比于其他微生物, 解脂耶氏酵母的脂质代谢相关途径已经得到了广泛的研究, 它拥有大量的基因工程工具, 且基因组已经被完全测序[11]。最近, 无处不在的基因组编辑技术CRISPR-Cas9在解脂耶氏酵母中也得到了应用, 它允许高频同源重组以及有针对性的基因插入和删除[12]。凭借这些独特的新陈代谢特性和最近开发的大量基因工程工具, 这个工业宿主在未来大量新产品的经济和可再生生产方面显示出巨大的希望。

1.3解脂耶氏酵母油脂积累和降解途径

在解脂耶氏酵母体内油脂可通过两种不同的途径积累[13]：(1) de novo途径, 指以亲水性碳源 (如糖、有机酸和醇) 为底物, 在特定条件下产生脂肪酸前体, 如乙酰CoA和丙二酰CoA, 并将其整合到Kennedy途径中合成油脂；(2) ex novo途径, 指以疏水性碳源 (如脂肪酸、三酰甘油和动物油脂) 为底物, 这一途径需要疏水底物 (HS) 的水解, 水解的脂肪酸在细胞内运输, 以不变或修饰的形式在细胞内积累被重新组装为TAG和甾酯 (SE), 并在脂质体 (LB) 中积累。图1-1总结了脂质合成及降解的途径。

在此, 本文只简述解脂耶氏酵母通过de novo途径合成脂肪酸与三酰甘油的代谢过程。当培养基中的氮变得稀缺时, 此过程被激活, 从而引起一系列级联调节反应。首先, 氮限制会导致AMP脱氨酶1 (AMPD1) 的酶活受到限制, 使得酵母细胞内AMP含量快速下降, 进而引起异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 活力下降, 导致三羧酸 (TCA) 循环的下调, 使得柠檬酸在线粒体中积累, 最后过量的柠檬酸从线粒体分泌到细胞质中。下一步, 细胞质中的柠檬酸被ATP-柠檬酸裂解酶 (ACL) 裂解为细胞质乙酰CoA和草酰乙酸。该途径不同于传统酵母所用的丙酮酸-乙醛-乙酸途径, 是产油酵母的特征途径。

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