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摘 要

姜黄素糖苷化是提高其水溶性以及稳定性的一种有效手段，Leloir糖基转移酶是催化糖苷化的主要酶之一。Leloir糖基转移酶具有很高的立体特异性，可以在单步转化中实现高精度的糖苷合成。但糖基转移酶自身固有的短板限制了其大规模应用：它的稳定性较低以及特异性底物为价格昂贵的糖核苷酸（如UDPG），因此不适用于大规模生产。而蔗糖作为价格低廉的底物，则十分适合于工业化生产。蔗糖合酶以蔗糖为底物、将葡萄糖残基转移至UDP分子上，分解生成UDP-葡萄糖和果糖，从而成为Lelior糖基转移酶的底物。

本实验采用基因工程手段将蔗糖合酶基因AtSUS1与糖基转移酶基因UGT76G1插入质粒pRSFDuet1。将所得重组质粒pRSF-AtSUS1-76G1导入大肠杆菌并诱导产酶。建立不同体系持续催化姜黄素糖苷化，并对其催化效率做出评价。最终测得，蔗糖浓度为50 mM时，双酶体系催化19 h后姜黄素转化率达到95.7%。

关键词：糖苷化 糖基转移酶 蔗糖合酶 姜黄素

Enzymatic synthesis of curcumin glycoside

Abstract

The glycosylation of curcumin is an effective method to improve its water solubility and stability. The enzyme that catalyzes the glycosylation of curcumin is the Leloir glycosyltransferase. Leloir glycosyltransferases catalyze glycosylation with high stereospecificity and in a single step, bringing about high-precision glycoside synthesis. However, the inherent short board of glycosyltransferase has limited it. Its stability is not so good and the glycosyl donor it uses is the UDPG, which is too expensive for large-scale application. In contrast, as a low-cost substrate, sucrose is more suitable for industrial production. In the presence of UDP, sucrose synthase can decompose sucrose into UDP-glucose and fructose, thus becoming a substrate for Lelior glycosyltransferases.

In this experiment, genetic engineering was used to insert the glycosyltransferase gene UGT76G1 and the sucrose synthase gene AtSUS1 into one plasmid to obtain a new recombinant plasmid pRSF-AtSUS1-76G1. It was introduced into E. coli and induced enzyme production. Different systems were sstablished to continuously catalyze the glycosylation of curcumin and evaluate its catalytic efficiency. Finally, the conversion rate of curcumin reached 95.7% after catalyzed by the double enzyme system for 19 hours.

Key words: glycosylation; glycosyltransferase; sucrose synthase; curcumin

目录

摘要 I

ABSTRACT 2

第一章 文献综述 1

1.1姜黄素概述 1

1.1.1姜黄素简介 1

1.1.2 姜黄素的抗癌作用 1

1.1.3 姜黄素的应用 1

1.1.4 姜黄素衍生物及其复合物 2

1.2 姜黄素糖苷化 2

1.3 糖基转移酶 3

1.3.1 Leloir糖基转移酶 3

1.3.2.使用糖基转移酶催化合成姜黄素糖苷 3

1.3.3 偶联蔗糖合酶与糖基转移酶 4

1.4 本课题的研究思路及意义 4

第二章 重组大肠杆菌的构建及表达 6

2.1 前言 6

2.2 实验材料 6

2.2.1 实验仪器 6

2.2.2 实验试剂 7

2.2.3 菌株与质粒 8

2.3 实验方法 9

2.3.1 重组表达质粒的构建 9

2.3.2 琼脂糖凝胶鉴定 9

2.3.3 重组质粒转化大肠杆菌 10

2.3.4 重组质粒的诱导表达及粗酶液的制备 10

2.3.5 SDS-PAGE 方法 10

2.3.6 姜黄素糖苷标准溶液 11

2.3.7 不同糖基供体持续催化反应 11

2.3.8 不同蔗糖浓度持续催化反应 11

2.3.9 高效液相色谱（HPLC）测定底物、产物浓度 12

2.4 实验结果与讨论 12

2.4.1 琼脂糖凝胶验证 12

2.4.2 SDS-PAGE验证 13

2.4.3 姜黄素标品液相检测 13

2.4.4 不同糖基供体持续催化反应结果 14

2.4.5 三种体系液相检测结果对比 15

2.4.6 不同蔗糖浓度持续催化反应结果 17

2.4.7 姜黄素的转化 18

第三章 结论与展望 19

3.1 实验结论 19

3.2 实验展望 19

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1姜黄素概述

1.1.1姜黄素简介

姜黄素是一种黄色素，最早在姜科植物中提取出，属于比较稀少的多酚类化合物。姜黄素的结晶为橙黄色，有苦味，不溶于水和乙醚，易溶于冰醋酸和碱溶液^[1]。姜黄素分子两端分别具有羟基，在碱性条件下，容易发生共轭效应，所以当pH大于8时，姜黄素会由黄变红^[2]。现代化学中，可以利用此特性，将姜黄素作为酸碱指示剂^[3]。

长期以来，姜黄素作为一种常用的天然植物染色素被广泛地研究和应用在食品工业中，主要广泛应用于食品罐头、肠类制品、酱油以及卤制品的加工染色^[4]。随着姜黄素研究的不断深入，研究人员发现姜黄素具有广泛的药理活性，比如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗动脉粥样硬化等^[5-8]，其应用前景十分广阔。

1.1.2 姜黄素的抗癌作用

普遍认为，低浓度的姜黄素通过其抗氧化特性抑制炎症的发生^[9]。炎症是诱发癌症的主要元凶之一，Singh和Aggarwal的研究表明姜黄素通过抑制NF-κB的活性表现出抗炎活性^[10]。NF-κB信号传导是许多炎性癌症的关键信号传导途径之一，NF-κB在包括癌症在内的不同细胞环境中参与细胞因子暴露后参与组蛋白功能的修饰。姜黄素通过抑制NF-κB向细胞核转移，引起肿瘤产生相关炎性因子下调，降低肿瘤发生的的可能性。

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