论文总字数：18391字

摘 要

纤维素被认为是自然界中分布最广、储量最丰富的可再生资源，其高效生物转化为可发酵性的单糖或寡糖，对实现人类社会的可持续发展具有重要意义。纤维素酶水解纤维素是纤维素生物转化最有前途的方法之一，这一酶水解过程条件温和且污染少，但纤维素酶解依赖于多种酶协同作用，降解过程中使用的酶用量大、种类多，因此高昂的酶成本严重阻碍了纤维素酶转化技术的实际应用。固定化能实现酶的多次重复利用，为降低纤维素生物炼制的酶成本提供了可能，但传统的酶固定化技术中，载体是不溶性的，反应体系中固定化酶与纤维素实际上是固-固相反应，存在催化速率低、传质效率差等缺陷，因此开发新型载体材料，例如可溶可逆载体对发展纤维素酶固定化技术，提高酶转化效率具有重要意义。

本研究以实验室改造的持续性内切酶EG5C-1为研究对象，将可溶可逆性材料Eudragit S-100与Ni² 螯合，再与持续性内切酶EG5C-1结合，获得具有可溶可逆性能的固定化酶。以蛋白固定率、酶活回收率、蛋白载量、比酶活、单位载体的固定化酶活为指标，对酶的固定化条件进行优化。最后对游离酶与固定化酶的性质进行研究。

(1)对Ni² 吸附量、加酶量、固定化时间进行优化，得到最优的固定化条件。研究发现载体材料对Ni² 的饱和吸附量为3.42×10^-4 moL/g。考察了加酶量和固定化时间对酶EG5C-1固定化效率的影响，在加酶量为200 mg/g、固定时间为60 min的固定化条件下，蛋白载量为155.8mg/g，蛋白固定率为98.47%。固定化酶水解CMC的酶活力为68953.7 U/g，比酶活为442.7 U/mg，酶活回收率为95.93%。固定化酶水解微晶纤维素的活力为4597.6 U/g，比酶活为29.8 U/mg，酶活回收率为100%。

(2) 固定化酶的性质研究表明，固定化酶具有Eudragit S-100相似的可溶可逆性能，但溶解性向pH小的方向偏移。固定化酶EG5C-1的最适温度为60℃，这与游离酶的最适温度一致，但固定化改变了酶EG5C-1的最适pH，固定化后酶EG5C-1的最适pH从5.0变成了7.0。此外，固定化显著提高了酶EG5C-1的热稳定性。固定化后，酶与底物的亲和力有所下降。

关键词：持续性内切纤维素酶 固定化 Eudragit S-100 金属螯合

Study on immobilization of Endozyme EG5C-1 by soluble and reversible Polymer

Abstract

In nature, cellulose is considered as the one of the most abundant renewable resources. If it is successfully developed into glucose on an industrial scale, cellulose resources can become a new source of human food, animal feed, raw materials for fermentation industry, and energy. The advantages of hydrolysis for cellulose by cellulase include mild reaction conditions and less pollution, but the cost of cellulase is too high, which seriously hinders the widespread application of cellulase in cellulose saccharification. The enzyme immobilization technology provides the possibility to reduce the production cost of cellulase.

In this paper, the soluble and reversible material Eudragit S-100 is chelated with Ni² and then combined with the persistent endonuclease EG5C-1 to obtain an immobilized enzyme that still has soluble and reversible properties. The protein immobilization rate, enzyme activity recovery rate, protein load, specific enzyme activity, and unit carrier immobilized enzyme activity were used as indicators to optimize the enzyme immobilization conditions. Finally, the properties of free enzyme and immobilized enzyme were studied.

(1) Optimize Ni² concentration, enzyme addition, and immobilization time to obtain the optimal immobilization conditions. When the adsorption capacity of Ni² is 3.42×10^-4moL/g carrier, the amount of enzyme added is 200mg/g, and the fixed time is 60 min, the immobilization effect is the best, the protein load is 155.8mg/g, and the protein fixation rate is 98.47% . When CMC was used as substrate, the activity of immobilized enzyme was 68953.7U/g, the specific enzyme activity was 442.7U/mg, and the enzyme activity recovery rate was 95.93%. When Avicel was used as substrate, the activity of immobilized enzyme was 4597.6 U/g, the specific enzyme activity was 29.8U/mg, and the enzyme activity recovery rate was 100%.

(2) The immobilized enzyme has similar soluble and reversible properties as Eudragit S-100, but moves in the direction of low pH. The optimum temperature of immobilized enzyme is equivalent to that of free enzyme, both are 60℃. The optimal pH of the immobilized enzyme was 7.0, which is 5.0 for free EG5C-1. The thermally stabilized enzyme at 45°C is significantly better than free enzyme. The affinity of the enzyme to the substrate decreased when EG5C-1 was immobilized onto the support.

Key Words: Persistent endo-cellulase; Immobilization; Eudragit S-100; Metal chelation

目 录

摘 要 I

目 录 V

第一章 绪论 1

1.1 研究背景及意义 1

1.2 纤维素与纤维素酶 1

1.2.1 纤维素的化学组成和结构 1

1.2.2 纤维素酶的种类 1

1.3 酶的固定化技术 2

1.4 酶的固定化方法^[6-8] 2

1.4.1 吸附法 2

1.4.2 共价偶联法 3

1.4.3 交联法 3

1.4.4 包埋法 3

1.5 纤维素酶的固定化载体 4

1.5.1 不溶性载体 4

1.5.2 可溶性载体 4

1.5.3 可溶性-不溶性载体 5

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌株与培养基 6

2.2 实验仪器与试剂 6

2.2.1 实验仪器 6

2.2.2 实验试剂 6

2.3 实验方法 6

2.3.1 持续性内切酶EG5C-1在Eudragit S-100上的固定化 6

2.3.2 纤维素酶活力的测定方法 7

2.3.3 蛋白含量的测定方法 8

2.3.4游离酶与固定化酶的性质研究 9

第三章 结果与讨论 11

3.1 持续性内切酶EG5C-1的固定化条件优化 11

3.1.1 Ni² 浓度优化 11

3.1.2 加酶量优化 12

3.1.3 固定时间优化 12

3.1.4 最优固定化条件 13

3.2 游离酶与固定化酶的性质研究 13

3.2.1 pH对固定化酶溶解性的影响 13

3.2.2 游离酶与固定化酶的最适温度 14

3.2.3 游离酶与固定化酶的最适pH 15

3.2.4 游离酶与固定化酶的热稳定性 15

3.2.5 游离酶与固定化酶的动力学参数 16

第四章 结论与展望 17

4.1结论 17

4.2展望 17

参考文献 18

附 录 20

致谢 22

第一章 绪论

1.1 研究背景及意义

当前全球的化石资源日益枯竭，能源、资源的短缺已成为人类社会可持续发展的主要瓶颈。纤维素是地球上最丰富的可再生资源，如果将其转化为可发酵性的单糖或寡糖如葡萄糖、纤维二糖等，将可有效缓解能源资源紧缺、开拓新的经济增长点、保护生态环境，对现实经济可持续发展，具有十分重要的战略意义。纤维素酶能高效水解纤维素生成可发酵性的单糖或寡糖，整个酶转化过程条件温和且污染少，是纤维素资源化利用的最佳途径。但降解过程酶用量大、种类多，过高的酶成本严重阻碍了酶转化技术在纤维素生物转化中的应用。酶的固定化技术能降低纤维素酶的使用成本。因为纤维素是不溶性的，因而利用传统的载体固定化纤维素酶存在与底物接触困难、转化效率低等问题，而可溶性载体则存在回收困难的问题。因此可溶-可逆载体则解决了回收困难和与底物接触困难这两大问题。因此，利用可溶可逆聚合物固定纤维素酶具有重要的研究意义。

1.2 纤维素与纤维素酶

1.2.1 纤维素的化学组成和结构

纤维素是植物细胞壁的主骨架，主要是通过β-1，4-糖苷键连接葡萄糖形成的纤维素长链，而纤维素链与链之间则存在强烈的氢键和范德华力作用，因此进一步聚集成微纤丝。在纤维素组分中，有可细分为结晶区和无定型区。结晶区的纤维素链排列整齐、有规则、紧密、分子链取向好，难以被酶降解。而无定形区主要是由纤维素链的不规律排列所构成，容易被降解^[1]。

1.2.2 纤维素酶的种类

纤维素酶是一类能水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的酶类总称。目前研究表明，完整的纤维素酶系至少包括三种作用不同，但彼此协同作用的酶类:(1) 内切葡聚糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4)，它的作用底物主要是羧甲基纤维素钠(CMC)。这类酶主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解纤维素链的β-1,4-糖苷键，产生大量的短链纤维素或纤维寡糖。(2) 外切葡萄糖苷酶(exo-1,4-β-D-glucanase， EC3.2.1.91)，这类酶作用于纤维素链的还原末端或非还原末端，水解β-1,4-糖苷键，其主要水解产物是纤维二糖。 (3) β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase， EC3.2.1.21，简称 BG)^[2-3]，该类酶主要是水解纤维二糖或纤维寡糖生成葡萄糖。

1.3 酶的固定化技术

酶固定化技术是指通过化学或物理手段，在酶和载体间产生相互作用，从而将游离酶固定在载体材料的特定区域内，虽然酶被束缚但其仍具有催化活性，能够催化特有的化学反应，还实现了酶的高效回收和重复使用。固定化酶一方面仍能具有游离酶高效和专一的催化特性，另一方面固定化酶还具有稳定性好、分离回收容易、可多次重复使用等优点。当前酶固定化技术在工业生物催化、医药、食品、能源等多个行业的生产和科研领域均有了广泛的应用。适合的载体以及酶与载体连接方式的选择是实现酶固定化技术成功应用的两个关键所在 ^[4-5]。

从载体而言，优良的酶固定化载体材料需要具有1）良好的热、化学稳定性；2）较高的蛋白吸附/负载能力；3）不易造成酶失活；4）价格低廉等特点。多年来，各国研究者以将多种无机或有机材料应用于酶的固定化，包括海藻酸盐、二氧化硅、磁性颗粒、凝胶、介孔材料、金属骨架材料等，但这些传统的固定化材料往往是水不溶性的，在传统的酶催化体系中，易于回收，但由于纤维素是水不溶性的，这些材料在纤维素酶固定化的应用中存在局限性。

1.4 酶的固定化方法^[6-8]

目前最常用的酶固定化方法主要包括了吸附法、共价法和包埋法等，这些方法各具优势但也存在局限性，在实际应用中需要根据酶的特性及其催化体系选择不同的固定化方法。

1.4.1 吸附法

吸附法主要通过酶与载体间存在的范德华力、氢键、亲和力、疏水作用等作用力将酶吸附在载体材料的表面。物理吸附是通过疏水键、氢键等物理作用力将酶固定化在载体上。离子交换法是利用组成酶的氨基酸残基侧链基团和树脂的离子交换基团之间的相互作用实现酶的固定化。吸附法的主要优势是能保持酶的空间结构，固定化过程酶不易失活，此外该方法工艺简便和条件温和，但其与载体的结合力较弱，酶易于从载体上脱落，固定化酶的重复使用次数较少。目前主要用于吸附法的载体材料主要包括天然或合成的无机及有机高分子材料，例如碳纤维材料、介孔分子筛、凝胶型的离子交换树脂等。

1.4.2 共价法

共价法是通过酶表面氨基酸残基的侧链基团与载体上的功能基团发生化学反应形成共价键，从而将酶固定化在载体上的一类方法。适用于固定化的酶功能基团主要包括：（1）氨基，主要是赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸侧链含有氨基基团，然而绝大多数酶表面含有更多的是赖氨酸，因此许多酶固定化技术中主要是利用酶表面的赖氨酸与载体材料共价结合；（2）羧基，主要是天冬氨酸和谷氨酸的侧链含有羧基基团，与载体材料的氨基功能基团共价结合；（3）酚基，主要利用苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸侧链含有的苯环或衍生物与载体材料的功能基团发生共价连接；（4）巯基或羟基，主要利用丝氨酸或半胱氨酸的羟基与巯基与载体材料功能基团发生共价作用，固定化目标酶；（5）咪唑基，主要是利用组氨酸的咪唑基侧链与载体材料共价连接，实现酶的固定化.相比而言，目前在共价固定化中，最常用的是利用氨基酸侧链的氨基、羧基和芳香环进行酶的共价固定化。

请支付后下载全文，论文总字数：18391字