论文总字数：22357字

摘 要

植物来源糖基转移酶是修饰形成植物次生代谢产物过程中的重要酶，参与进植物的脱毒、极端生长环境的适应、抵御反应的过程，对于植物细胞的代谢平衡调节有着非常重要的意义。同时，此类糖基转移酶也可以被应用于医药、农业、食品加工业等。将表达植物糖基转移酶的基因片段通过基因工程的手段转移至宿主中进行异源表达，可以得到催化反应效果优异的糖基转移酶。其中番茄来源的UDP-糖基转移酶UGTSL2是催化形成莱胞迪苷D的关键酶，为本论文的研究主体。其催化所得莱胞迪苷D是高纯度甜菊糖苷重要发展方向，具有高甜低热、降血脂、降血糖、抗肿瘤、抑菌抗炎等优点。天然植物甜叶菊中莱胞迪苷D含量极少，提取成本过高，一般都是通过生物酶合成法催化获得。本论文主要对糖基转移酶UGTSL2进行相关性质的研究，通过基因工程手段构建pRSFDuet-UGTSL2质粒，以大肠杆菌为宿主异源表达UGTSL2，诱导产酶，构建酶活测定反应体系。以超滤和亲和层析的组合纯化方法对UGTSL2进行纯化，计算纯化前后比酶活探索UGTSL2纯化条件，测定其动力学参数。结果表明，当UGTSL2被镍柱吸附时，使用含有70 mM咪唑的磷酸钠缓冲液纯化效果最好，而且纯化后的比酶活约为纯化前73倍。以莱胞迪苷A为底物时UGTSL2的K_m值大于以莱胞迪苷D为底物时UGTSL2的K_m值，在生成莱胞迪苷D的过程中较容易生成副产物莱胞迪苷M2。下一步需要对酶进行改造，以减少副产物的生成。

关键词：糖基转移酶、甜菊糖苷、蛋白纯化

Abstract

As an important enzyme modifying plant secondary metabolites, plant-derived glycosyltransferase is involved in the process of plant detoxification, adaptation to extreme growth environment and resistance reaction, which is of great significance to the metabolic balance regulation of plant cells.T At the same time, glycosyltransferases can also be used in medicine, agriculture, food industry, etc. The gene fragments expressing glycosyltransferase were transferred to the host for heterologous expression by genetic engineering. Thus, glycosyltransferase with excellent catalytic effect could be obtained. UGTSL2, a UDP-glycosyltransferase from solanum lycopersicum, is a key enzyme that catalyzed the formation of high purity Stevia rebaudiana extract—rebaudioside D, and is the main body of this paper.As an important development direction of high purity Steviol glycosides it has the advantages of high sweet and low heat, lowering blood lipid, lowering blood glucose, anti-tumor, bacteriostatic and anti-inflammatory.However, the content of rebaudioside D in S. rebaudiana was very small, which was mainly synthesized by enzyme biosynthesis method instead of high cost extraction.In this paper, the relevant properties of UGTSL2 were studied. We need to construct pRSFDuet-UGTSL2 plasmid by means of genetic engineering ,heterogeneously express UGTSL2 by E.coli as the host to induce enzyme production and establish a reaction system for the determination of enzyme activity. UGTSL2 was purified by the combination of ultrafiltration and affinity chromatography. Then, the specific activity before and after purification and the kinetic parameters are essential for purification conditions.The results showed that when UGTSL2 was adsorbed by nickel column, the purification effect of 70 mM imidazole is the best,And the specific activity after purification was about 73 times more than that before purification.The K_m of UGTSL2 in the presence of rebaudioside A is higher than the Km of UGTSL2 in the presence of rebaudioside D, and it is easier to generate rebaudioside M2 as a by-product in the process of producing rebaudioside D.The next step is to modify the enzyme to reduce by-product production.

Key words: glycosyltransferase、stevioside、protein purification

目 录

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 糖基转移酶 1

1.2.1 糖基转移酶的分类 1

1.2.2 糖基转移酶催化机制 3

1.3 甜菊糖苷 3

1.3.1 甜菊糖苷介绍 3

1.3.2 甜菊糖苷传统工艺制备 4

1.3.3 甜菊糖苷生物酶合成法 5

1.3.4 UGTSL2催化原理 5

1.4 酶的纯化 6

1.4.1 酶纯化意义 6

1.4.2 酶纯化方法 6

1.5 本论文的立题意义和研究内容 8

第二章 质粒的构建、表达以及酶活测定反应体系的建立 9

2.1 前言 9

2.2 实验材料 9

2.2.1 工具酶、试剂盒 9

2.2.2 菌种、质粒 10

2.2.3 试剂 10

2.2.4 设备仪器 10

2.3 实验方法 11

2.3.1 制备培养基 11

2.3.2 培养重组菌 11

2.3.3 提取粗酶液 12

第三章 酶的纯化与活性测定 13

3.1 前言 13

3.2 粗酶酶活测定 13

3.3 粗酶纯化 13

3.4 SDS-PAGE电泳 13

3.5 纯酶酶活测定 14

3.6 Km测定 14

3.7 标准曲线样品配置 14

3.8 HPLC 测定 14

第四章 分析与讨论 15

4.1 质粒构建验证 15

4.2 标准曲线绘制 15

4.3 纯化结果分析 17

4.4 UGTSL2动力学参数 19

第五章 参考文献 21

致谢 23

文献综述

前言

植物体中普遍存在着糖基转移酶（glycosyltransferases,GT）。糖基转移酶是在糖基化反应中一种可以识别糖基受体（小分子化合物如蛋白质、核酸、寡糖、脂类、激素等）并在受体上修饰糖基成分的糖基化酶^[1]。经过糖基化修饰的小分子其化学稳定性、水溶性、识别与转运能力等性质会得到显著的改变^[2]，从而更加有效的参与进植物细胞的代谢平衡调节之中。另外，糖基转移酶在面对植物体内内外源性毒素时，可以与毒素发生糖基化反应从而发挥脱毒作用。在干旱、严寒、病虫害等逆境的生长环境中，某些糖基转移酶可以通过高效的诱导表达来提高植物的抗性^[3]。糖基转移酶是植物生长过程中不可缺少的一部分。许多由糖基化反应得到的糖苷类化合物在医药、农业^[4]、食品加工业等也有了极大程度的开发与使用，人们对于糖苷类化合物的需求只增不减。由于天然植物中所需糖苷类化合物含量少、植物体内成分复杂提取难度大；而化学合成法无法实现定点糖基化修饰并伴随着环境污染问题，生物酶催化糖基化反应得到了重视，对于糖基转移酶的研究与日俱增。^[5]

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