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1. 摘要

beta;-半乳糖苷酶（beta;-galactosidase），简称乳糖酶（lactase），普遍存在于动物组织、各种植物以及微生物中，能水解多糖或寡糖中的beta;-半乳糖苷键，一些beta;-半乳糖苷酶也能催化转糖基反应生成低聚半乳糖。beta;-半乳糖苷酶可广泛应用于乳品，食品及分子生物学研究中。凝结芽孢杆菌NL01beta;-半乳糖苷酶是一种具有优异的水解性能的耐热酶，对乳糖具有优秀的完全水解能力，可以应用于乳糖不耐症的治疗及乳清乳糖的预水解。本实验对半乳糖苷酶的产物抑制进行了研究，产物半乳糖的存在会抑制半乳糖苷酶的活性，导致分解效率大大的降低。目前，国内外对葡萄糖苷酶的产物抑制研究较多，而关于beta;-半乳糖苷酶的研究很少，基于这一点本实验将利用分子生物学的手段对半乳糖苷酶的结合位点或者催化位点进行定点突变，来解除产物抑制。本论文首先异源表达来源于凝结芽孢杆菌NL01的beta;-半乳糖苷酶，并结合分子模拟的手段对NL01beta;-半乳糖苷酶产物抑制的结构基础进行研究。在此基础上通过蛋白理性设计，定点突变对产物抑制予以解除。项目的完成不仅可以为beta;-半乳糖苷酶产物抑制结构基础研究奠定理论基础，还可为提供新型的工业酶，具有较强的应用价值。

关键词： 凝结芽孢杆菌 beta;-半乳糖苷酶 产物抑制 分子改造 结构分析

2.文献综述

2.1 beta;-半乳糖苷酶概述

beta;-半乳糖苷酶(EC.3.2.1.23)又称乳糖酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，它能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖。某些种类的beta;-半乳糖苷酶在水解乳糖分子中beta;-1，4半乳糖苷键的同时，还具有转半乳糖基作用，以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，合成半乳糖苷键，生成低聚半乳糖^[1]。不同微生物来源的beta;-半乳糖苷酶的水解活性和半乳糖基转移活性的比例不同。某些微生物，如Kluyveromyces lactis，K. fragilis，Aspergillus niger等所产生的beta;-半乳糖苷酶具有较强的水解活性；而某些微生物，如Lactobacillus bulgaricus，Streptococcus thermophilus，Aspergillus oryzae，Bacillus circulans，Bifidobacterium sps.等所产生的beta;-半乳糖苷酶则具有较强的半乳糖基转移活性。^[2]

2.2 beta;-半乳糖苷酶来源及性质

2.2.1 beta;-半乳糖苷酶来源

beta;-半乳糖苷酶广泛存在于各种动物、植物以及微生物中。beta;-半乳糖苷酶的主要来源有：①细菌、霉菌、酵母菌等微生物，如：细菌中的乳酸菌、大肠杆菌，霉菌中的米区菌、黑曲菌，酵母中的脆壁克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母，放线菌中的天蓝色链霉菌；②植物，尤其是杏、扁桃和苹果；③哺乳动物，特别是幼小哺乳动物的小肠中。目前，仅来源于微生物的beta;-半乳糖苷酶有工业应有价值，商业用酶源一般认为酵母(如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母)最为安全，其次为黑曲霉。^[3,4]

2.2.2beta;-半乳糖苷酶的性质

beta;-半乳糖苷酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶^[5]，如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产beta;-半乳糖苷酶均为胞外酶，脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。霉菌作用最适 pH 偏酸性（pH2.5-5.0），酵母和细菌所产beta;-半乳糖苷酶最适 pH 近中性(分别为 pH 6-7 和 pH6.5-7.5) ^[6]，因此，最适 pH 决定了各自的用途，如霉菌所产beta;-半乳糖苷酶适用于酸性乳清和干酪的水解(含大量乳糖) , 酵母和细菌beta;-半乳糖苷酶适于牛乳( pH6. 6) 和鲜乳清 ( pH 6. 1) 的水解。