摘 要

随着对绿色食品和环境保护的重视，人们逐渐感受到化学农药对生态环境和人类社会造成的巨大压力。农用抗生素作为一种生物农药，拥有化学农药所无法比拟的优势，其具有高效、无污染、易分解、无残留、与环境相容性好等优点。多抗菌素（Polyoxins）作为一种农用抗生素，是一系列结构相类似的肽嘧啶核苷类抗生素，共由A-N 14种不同的成分组成，广泛应用于防治番茄灰霉病、水稻纹枯病和梨黑斑病等植物真菌病害。

本实验建立了管碟法检测发酵液中多抗菌素含量的方法。将水稻纹枯菌作为指示菌株，结果显示多抗菌素标准品在质量浓度为200-2400 μg/mL 范围内线性关系良好，其线性回归方程为：Y=138.23X-2058.46，相关系数R2=0.9984。通过对该方法进行评价，其精密度相对标准偏差RSD=1.51%，平均回收率=100.1% (n =4)，样品在24 h内稳定。该方法重复性较好，对仪器要求低，具有直观、可靠、检测简单、费用低廉的优点，能够特异性的显示多抗菌素的抑菌能力。

关键词 多抗霉菌；生物检测 ；发酵优化

ABSTRACT

As green food and environmental protection attach more and more attention in our country, people gradually feel the pressure of ecotope and society from chemical pesticide. Agricultural antibiotic is a kind of biopesticide which is superior to chemical pesticide on its high-efficient, non-pollution, labile, non-residue and environmental friendly. Polyoxins, a kind of agricultural antibiotic, are a series of peptide pyrimidine nucleoside antibiotics which have 14 similar structures from A to N, which are widely used to protect crops from Botrytis cintrea, Pellicularia sasakii, Alternaria kikuchiana and so on.

This work used cup-plate method to measure the content of polyoxins. Pellicularia sasakii was used as the indicator strain. It was proved that the linearity of concentration of polyoxins was good in the range of 200-2400 μg/mL, and the equation was: Y=138.23X-2058.46, R2=0.9984. The value of relative standard deviation (RSD) is 1.51%. The value of average recovery rate is 100.1% (n=4), and the sample kept stable in 24h. This method had a high repeatability, low requirement on equipment and is intuitionistic, reliable, easy and cheap. Besides, it could show the bacteriostatic activity of polyoxins specifically.

KEYWORDS: Polyoxins; Bioassay; Fermentation optimization

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章文献综述 1

1.1多抗霉素概述 1

1.1.1农用抗生素简介 1

1.1.2多抗霉素简介 2

1.1.3多抗霉素理化性质 3

1.1.4 多抗霉素的抑菌机制 3

1.1.5多抗霉素的研究进展 4

1.1.6多抗霉素在农药上的应用 5

1.2本研究的目的和意义 5

1.2.1 本研究的目的 5

1.2.2 本研究的意义 6

第二章 多抗菌素微生物检测法 7

2.1实验材料与方法 7

2.1.1 实验菌种 7

2.1.2 培养基 7

2.1.3 主要试剂 7

2.1.4 主要仪器 8

2.2实验方法 8

2.2.1标准溶液配置 8

2.2.2发酵液前处理 8

2.2.3 管碟法检测多抗菌素含量 8

2.2.4 线性实验 9

2.2.5 牛津杯最佳装液量 9

2.2.6稳定性实验 9

2.2.7精密度实验 9

2.2.8 回收率实验 9

2.3 结果与讨论 10

2.3.1 标准曲线 10

2.3.2 牛津杯最佳装液量 10

2.3.3 稳定性实验 11

2.3.4 精密度实验 11

2.3.5回收率实验 12

2.4 本章小结 12

第三章 多抗菌素摇瓶发酵条件初探 13

3.1 实验材料与方法 13

3.1.1 实验菌种 13

3.1.2 培养基 13

3.1.3 主要试剂 13

3.1.4 仪器设备 13

3.2 实验方法 14

3.2.1 测定菌丝体干重（DCW） 14

3.2.2 测定发酵液中多抗菌素含量 14

3.3 发酵培养基优化 14

3.3.1 最适种龄筛选 14

3.3.2 发酵培养基单因素实验 15

3.3.3 筛选最适接种量 15

3.3.4 筛选最适最初pH 16

3.4结果与讨论 16

3.4.1 最适种龄筛选 16

3.4.2 氮源对多抗菌素发酵的影响 16

3.4.3碳源对多抗菌素发酵的影响 17

3.4.4 前体对多抗菌素发酵的影响 17

3.4.5 筛选最适接种量 17

3.4.6 筛选最适最初pH 17

3.5本章小结 18

第四章 结论与展望 19

4.1结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致 谢 21

第一章文献综述

1.1多抗霉素概述

1.1.1农用抗生素简介

农用抗生素(Agricultural antibiotics），是由微生物代谢所产生的一类次级代谢产物，是生物农药最重要的分支。主要用于防治农作物生长过程中的草害、虫害和病害，部分农用抗生素甚至对农作物表现出优良的调节促进生长作用^[1,2]。目前，市场上主要流行的几类农用抗生素大多是由链霉菌属微生物发酵代谢所产生的。与传统的化学农药相比，农用抗生素主要有以下几点优势：①在生态环境中易于降解，不会对环境累计毒性且对人畜安全；②底物原料来源广，绿色可循环；③生物活性高，低浓度下就有较好的抑制效果；④设备利用率高，整体投入较少^[3]。这为农用抗生素的发展开拓了广阔的空间以及为绿色生物农药的发展指引了新的方向。

农用抗生素从作用机理上可分为除草、杀虫和杀菌抗生素三类（表1-1）。最早是在欧美等地区将医用链霉素用于防治植物病害^[4]。上世纪50 年代，日本和美国等国家科学家开始使用医用抗生素如链霉素（ Streptomycin ）、灰黄霉素（Griseofulvin）等防治水果、蔬菜等植物病虫害，并取得了一定的效果^[5]。但是与化学农药相比，当时农用抗生素的生产成本较高且效果不够显著，导致其发展较为缓慢。直到1958 年，日本科学家Takeuch 成功从链霉菌发酵液中成功分离出针对稻瘟病的抗生素灭瘟素（Blasticidin-S），并在随后的3 年里将其大规模应用于防治稻瘟病，大大推动了农用抗生素的研发与发展^[6]。随后，井冈霉素(Validamycin)、春日霉素(Kasugamycin)、多抗菌素(Polyoxins)等高效、低毒、无公害的新品种相继被成功研发并推广应用，此类生物农药有逐渐取代化学农药的趋势，这也使得欧美各国开始加紧对农用抗生素的研发投入。