文 献 综 述

1.1 引言

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[1]是参与生物体内的大多数氧化还原反应的重要辅酶，其在体内以两种形式存在：氧化态的NAD 和还原态的NADH。NAD 和NADH可发生可逆性的转变，因此，生物体内的NADH/NAD [2]比率反应了生物体内的氧化还原状态，对微生物的代谢网络有很重要的影响。微生物体内NAD 及NADH水平的改变会对微生物的代谢水平产生有显著作用。在微生物体内改变NAD 及NADH水平的方法有很多，NAD从头合成途径就是其中一条途径[3]。而NAD合成酶( nadE ; EC 6. 3. 1. 5 ) 广泛存在于生物界中。微生物对NAD合成酶的依赖性比人体更高，同时NAD 合成酶在微生物与人体之间有着很大的差异[4]，如人体与结核分枝杆菌的NAD 合成酶在一级结构的相似度仅有23%[5]。

基因克隆即重组DNA技术，指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接，组装成一个新的DNA分子。在此基础上，将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞，使它能够在宿主细胞中扩增，形成大量的子代分子，此过程即称为基因克隆[6]。聚合酶链式反应是最常见的，用以在体外大量扩增DNA的一项技术[7]。

酶学性质包括最适作用温度及其热稳定性，最适pH及pH稳定性，不同金属离子对酶活力的影响，酶对辅酶的依赖性，酶的有机溶剂稳定性以及对底物的特异性[8]。其中酶活力的测定可使用紫外分光光度计法进行测定。

1.1.1 NAD合成酶的分类

20世纪50年代后期NAD合成酶活性首次见报道[9]。它催化NAD生物合成过程中最后一步反应:将NaAD转变为NAD[10]。根据NAD合成酶对氨来源的偏好性的不同可以将其分为2类:氨－依赖型NAD合成酶和谷氨酰胺-依赖型NAD 合成酶。前者只能完成直接以NH3作为氨源的反应NaAD NH3 ATP→NAD AMP PPi，它仅分布于原核生物;后者既可完成以NH3作为氨源的合成反应也可进行以谷氨酰胺作为氨源的反应，NaAD 谷氨酰胺 ATP→NAD 谷氨酸 AMP PPi[11]，它分布于真核生物和部分原核生物[4]。

1.1.2 聚合酶链式反应简介

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。聚合酶链式反应包含：1.一种热稳定DNA聚合酶催化模板依赖的DNA合成；2.一对引导DNA合成的寡核苷酸引物；3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）；4.二价阳离子；5.维持pH值的缓冲液；6.一价阳离子；7.模版DNA[7]。

1.1.3 聚合酶链式反应的设计