文 献 综 述

一.引言

酶反应一般都在水溶液中进行，属于均相反应。均相酶反应系统在使用过程中有许多不足之处， 如酶稳定性差，在温度pH和离子强度等外界因素的影响下容易变性失活，酶与底物和产物混在一起难于回收利用给产物的进一步分离纯化也带来一定的困难，为克服以上缺点逐渐发展起酶的固定化技术。固定化技术是使酶得到更广泛应用的重要手段，在食品与发酵工业、医药工业、化学工业、环境保护和能源等领域具有广阔的应用前景^[1]。采用固定化酶技术不仅可实现酶制剂的回收和重复使用^[2,3]，利于生产工艺的连续化、自动化，同时也可有效提高酶的稳定性。作为固定化酶技术的重要组成部分，载体的结构及性能在很大程度上直接影响所得固定化酶的催化活性及操作稳定性，在固定化酶技术中, 载体微环境对固定化酶活性的影响井常复杂, 主要有两大类：①各种分子、离子在本体溶液和微环境中不同分布的作用; ②微环境对底物和产物分子扩散的影响。由于这些影响, 大多数固定化酶的pH#8212;#8212;活性曲线都有不同程度的变化，特别是当载体带有离子基团时，变化更为显著^[4]。本实验拟用固相合成方法对酶固定化载体DEG-AM树脂进行表面电荷修饰，并对其进行表征，通过表征观察其修饰前后物性变化，以期得到优良的固定化载体。

二.多肽的固相合成

1.基本原理

多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程^[5]，合成一般从C端(羧基端)向N端( 氨基端)合成。首先将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与固相载体相连，再以这一氨基酸的氨基为合成起点，经过脱去氨基保护基并同过量的活化的第二个氨基酸反应，接长肽链^[6]。重复(缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合)操作^[7]，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽^[8]。

2.合成方法

固相多肽合成在近几十年的发展中逐渐分化为2种类型。① Merrifield固相合成，也称为Boc固相合成。②Atherton和Shepard所发展的Fmoc固相合成法^[7]。

Boc固相法(经典Merrifield固相法)在Boc固相法中，氨基保护基采用TFA可脱除的Boc。侧链保护基采用苄醇类。常用的树脂为氯甲基化或羟甲基化聚苯乙烯树脂，最近更广泛采用较氯甲基树脂稳定100倍的对乙酰基苄酯(PMA)树脂。合成肽酰胺时采用二苯甲胺型树脂。Boc保护α-氨基的氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用三氟乙酸(TFA)脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后再偶联下一个氨基酸^[9]。最终脱保护基多采用HF法和TFMSA法。用Boc固相法已合成了许多生物大分子，如酶、生长因子、人工蛋白等^[10]。

Fmoc固相法1970年由Carpino和Han提出了一种烷氧羰基型氨基酸保护基Nα-芴甲氧羰基(Fmoc)，该方法与经典固相多肽合成相比，具有反应条件温和、副反应少、产率高等优点^[11]，被广泛用于各种活性多肽的合成^[12,13]。在Boc固相合成中反复用酸脱除保护基，然后用氟化氢把肽段从树脂上裂解下来，不可避免地会引起或多或少的副反应，其中包括某些侧链保护基的不稳定，已延长的肽链从固相支持物上的逐步损失，还有Asp、Glu等氨基酸残基的侧链变化等^[14]。Fmoc作为氨基保护基的优点在于它对酸稳定，用TFA等试剂处理不受影响，仅需用温和的碱处理，通过β-消除反应即可脱去，不需用三级胺中和。肽段最后用TFA/CH₂Cl₂定量地从树脂上切除，避免了采用强酸，如液态氟化氢可能产生的氨基酰化等副反应。但Fmoc保护的氨基酸价格昂贵，合成成本也相应较高。