摘 要

本研究采用含有四个串联基因的穿梭质粒pXMJ19，成功构建重组C. glutamicum ATCC13032-MDH-RmpA-RmpB-ACT， 实现谷氨酸棒杆菌对于甲醇和葡萄糖的共利用。考察了该重组菌的生长与利用甲醇情况，经过研究发现，甲醇代谢使得细胞的比生长速率从0.41 h^-1 下降到0.32 h^-1.且该菌株在不添加葡萄糖的情况下，不具有以甲醇为唯一碳源的能力。

关键词：谷氨酸棒杆菌 甲醇 共利用

Construction and Optimization glutamicum methanol utilization pathway

ABSTRACT

Methanol is already an important carbon feedstock in the chemical industry, but it has found only limited application in biotechnological production processes. This can be mostly attributed to the inability of most microbial platform organisms to utilize methanol as a carbon and energy source. With the aim to turn methanol into a suitable feedstock for microbial production processes, we engineered the industrially important but nonmethylotrophic bacterium Corynebacterium glutamicum toward the utilization of methanol as anauxiliary carbon source in a sugar-based medium.

KEYWORDS: C. glutamicum； methanol；tatally use

目录

摘 要 I

ABSTRACT I

目录 III

第一章　　文献综述 1

1.1 单碳化合物与甲醇简介 1

1.2甲基营养菌简介 1

1.3 谷氨酸棒杆菌简介 2

1.4 立题意义 2

1.5 本论文的研究内容 4

第二章 　实验材料与试验方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 实验仪器 5

2.1.2 菌株与质粒 5

2.1.3 主要试剂 6

2.1.4 主要培养基的配置 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 目的基因的获取 8

2.2.2 酶切体系 8

2.2.3 连接体系 9

2.2.4 大肠杆菌及质粒DNA的提取 9

2.2.5 谷氨酸棒杆菌质粒DNA的提取 10

2.2.6 大肠杆菌的感受态细胞的制备及化学转化 10

2.2.7 谷氨酸棒杆菌的感受态制备 11

2.2.8谷氨酸棒杆菌的电转化 11

2.2.9 谷氨酸棒杆菌的发酵培养 12

2.2.10 发酵产物、葡萄糖及甲醇的测定 12

第三章 结果与讨论 14

3.1甲醇利用载体的构建 14

3.2 甲醇利用情况的表征 14

3.2.1 甲醇利用途径基因表达对谷氨酸棒杆菌生长的影响 14

3.2.2 甲醇利用途径基因表达对谷氨酸棒杆菌好氧发酵产物的影响 14

3.2.3 甲醇利用途径基因表达对谷氨酸棒杆菌厌氧发酵产物的影响 14

第四章 结论与展望 14

4.1结论 14

4.2展望 15

参考文献 15

致谢 16

第一章　　文献综述

1.1 　单碳化合物与甲醇简介

单碳化合物是指只含有碳碳单键的化合物（如甲烷、甲醛），此类化合物的结构一般相较于其他化合物而言相对简单且来源广泛。甚至很多物质是在工业农业生成中产生的副产物，有些还对人体有害带有毒性，给环境造成很大破坏和严重影响。由于上述原因，这些物质的处理就成为国内外研究者们关心的问题。其中关于甲醇的处理研究，也是全球科学家关注的焦点。

甲醇(CH₃OH)是一种有机化合物，是一种非常普通的一元醇类。甲醇本身并没有颜色，并且特别容易被点燃，且较容易挥发。是有机合成原理药品等重要的工业原料。甲醇本身具有非常强的生物可降解性，而这个特点对于生物法处理甲醇非常有利。生物法讲解甲醇不仅能有效解决污染问题，还能在处理污染的同时生产出蛋白质、氨基酸等具有应用价值的物质。所以从上个世纪开始，相关的研究就已经开展。

在这之中，最得到研究者们关注的，并且应用最广泛的是利用甲醇的微生物发酵来生产单细胞蛋白。。微生物在甲醇培养基中，发酵生产甲醇，生产许多单细胞菌体，称为菌体单细胞蛋白，简称SCP。被称为第二代单细胞蛋白的甲醇蛋白，营养价值比市面上的其他产品高出许多，甲醇蛋白其中所含有的粗蛋白的含量甚至高于鱼粉和大豆。甲醇蛋白共含有17中氨基酸，甚至还有动物体本身能无法合成的氨基酸。目前市场上甲醇蛋白大范围应用于动物饲料中。国外的科学家甚至在讨论如何将甲醇蛋白作为人类日常食品的蛋白质添加剂，具有着非常广泛的应用前景。

1.2甲基营养菌简介

甲基营养菌是一种可以利用一碳甲基单位化合物作为碳源和能源来生长的菌株，它们大部分是革兰氏阴性菌。在过去的二三十年，欧美日本等国的科学家对该菌种进行了大量的研究，特别是对于其分离、鉴定及生理学特征进行了许多研究。现在，全世界已经发现了一百多种可以进行甲基利用的菌株。这些微生物可以利用甲醇等其它单碳化合物来做为碳源进行生长，但是微生物本身不能利用甲烷来作为碳源和能源来进行生长。都有一个共同的特点，就是在同化碳源的过程中需要氧化甲醛。微生物利用甲基碳源的能力在在二十世纪以前就已经被研究生发现并广泛研究，但是知道上个世界六七十年代，研究者才对其同化机制有了相对比较详细的了解。

1.3 谷氨酸棒杆菌简介

谷氨酸棒杆菌是一种使用广泛的兼性厌氧菌株，具有生长快速等特点，是一种革兰氏阳性菌，因为它可以过量合成谷氨酸，所以被研究者们命名为谷氨酸棒杆菌。目前研究者和科学家们经过传统的诱变手段、基因工程呃定向改造等方法，使其已经可以用于其他氨基酸如甲硫氨酸、苏氨酸、谷氨酸、缬氨酸的生产。还可以应用于生物塑料及其他化学品的的生产。至今已有三株谷氨酸棒杆菌的基因组被测序，分别为：C. glutamicum ATCC13032（Kyowa Hakko and Kitasato University），基因组大小为3309401 bp；C. glutamicum ATCC13032（Degussa AG and Bielefeld University），基因组大小为3282708 bp；C. glutamicum R（Research Institute of Innovative Technology for the Earth），基因组大小为3314179 bp。

谷氨酸棒杆菌是一种目前工业生产中广泛使用的的菌，能够利用自然界中存在的大多数的碳源和有机酸。现在，全球对于谷氨酸棒杆菌生产氨基酸的相关讨论主要集中在利用葡萄糖作为碳源上，为了有效降低利用微生物合成附加值高产品的成本，从而提高生物产品的竞争力，国内外的科学家和研究者开始研究使用相对廉价底物比如玉米秸秆、麦秸秆稻草等来生产产品。然而野生型的谷氨酸棒杆菌却不能利用甲醇等廉价碳源。

1.4 立题意义

虽然以生物质为原料的生物合成法相比于传统的化学法有很大的优势，但如果进行大规模生产，原料的获得会存在问题。在当前全球粮食紧缺的大环境下，将生物质用于工业生产，会不可避免地与人争粮，很可能因为政策因素的限制，无法保证原料的持续供应，食品来源的葡萄糖价格昂贵，而纤维素来源获取单糖的技术瓶颈仍未突破；同时，如果氨基酸需求增加带动生物质价格的上涨，对于长期生产开发利用氨基酸也是不利的。针对以上问题，本研究拟开发以甲醇作为原料生产氨基酸的甲醇基生物合成法。