文 献 综 述

1 植物细胞悬浮培养研究概况

1.1植物细胞悬浮培养的概念和特点

植物细胞培养的概念包括植物器官、组织、细胞、原生质体及胚的培养，其核心理论依据是植物细胞的”全能性”( Totipotency )，它包括植物细胞的”形态全能性”(morphological totipotency)[1]和”化学全能性”( Chemical totipotency )[2]两方面的概念，即植物体的任何一个细胞都包含有整株植物全部的遗传信息，在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力。植物细胞悬浮培养(cell suspensionculture)即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养，这些细胞和小集聚体自愈伤组织、某个器官或组织、甚至幼嫩的植株，通过物理或化学方法进行分离而获得[3]。发展最早、应用也最广泛的植物细胞悬浮培养技术是植物单细胞或小细胞团悬浮培养。胚性悬浮细胞系是指在一定条件下具有体细胞胚发生能力的细胞悬浮培养物[4]。胚性悬浮细胞的特点是细胞小、圆球形、壁薄、质浓，胚性悬浮细胞系的特点是分离好、增殖快、培养液不混浊[5]。因此，一个成功的细胞悬浮培养体系必须满足三个基本条件:一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成，但很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，在倒置显微镜下观察为体积和形状大致相同的细胞团。三是生长迅速，悬浮细胞的量一般2~3d甚至更短时间便可增加一倍[3]。

1902年Haberldant试图培养分离的细胞，但是在该条件下细胞丧失分裂能力。20世纪30年代，White等人第一次尝试培养离体的西红柿根尖细胞获得成功。1953年，Muir首先在烟草和万寿菊细胞悬浮培养上取得成功，从而开创了建立单细胞无性繁殖系的工作。1956年，Nicked第一次证明了由菜豆下胚轴组织形成的高度分散的悬浮培养细胞可以像微生物一样进行培养，随后又用微生物发酵技术研究了悬浮培养细胞生长的动力学、生化组成和特殊代谢产物的产生，使细胞悬浮培养技术有了更加广泛的应用[7]。 1958年Steward等人首次由胡萝卜细胞悬浮培养经体细胞胚胎发生途径获得完整的再生植株。标志着细胞悬浮培养的真正开始[6]。20世纪70年代后人们看到了用细胞生产次生代谢产物的潜力，大量人力物力的投入使细胞悬浮培养技术得到快速发展。近年来利用植物细胞、组织和器官培养的方法生产药用活性物质的研究获得惊人的进展，已有近1000种植物进行过细胞培养方面的研究[7]。

2影响悬浮细胞体系建立和再生的因素

2.1愈伤组织和细胞悬浮体系的建立

愈伤组织继代培养过程中，常常出现多种类型的愈伤组织，许多研究者根据能否发生体细胞胚胎而将愈伤组织分为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织两种类型。只有胚性愈伤组织才有可能成功地建立胚性细胞悬浮系。但是大多数时候诱导出的愈伤不是胚性愈伤组织，不能直接用来建立悬浮细胞系。因此将这些类型的愈伤组织调控成胚性愈伤组织就显得十分重要。很多研究者为此进行了相关的研究:王海波[8]等在小麦原生质体培养中通过愈伤组织状态调控，将非胚性愈伤组织改造成胚性愈伤组织，并建立悬浮系，从而获得了小麦原生质体培养的成功。柑橘上，只有用胚性愈伤组织制备的原生质体才能持续分裂，再生植株，而非胚性愈伤组织来源的原生质体通常仅获得愈伤组织[9]。

诱导出愈伤组织后先调整其状态，使其形成淡黄色、致密的颗粒结构，选取这样的愈伤组织连续继代，可以建立起生长快，分化频率高的愈伤组织无性系[10]。杨跃生[11]、余舜武等[12]采用对愈伤组织再生有促进作用的铜离子作为筛选因子，避免了培养过程中愈伤组织丧失胚性。细胞悬浮培养初期，细胞的大小和形状均有很大差异，有圆形、长形和管状等各种形态。为了获得较为均一的圆形细胞和小细胞团，需进行不断的筛选。Durzan[13]在花旗松悬浮培养初期用100目尼龙滤布进行过滤，以除去大的细胞团。王影[14]等采用不断继代的方法，倾去上部漂浮的长形细胞和管状细胞，以得到由均一的圆形细胞组成的悬浮细胞系。

2.2细胞悬浮培养的条件