摘 要

麦角硫因具有多重抗炎和抗氧化特性，是体内重要的活性物质。它具有许多生理功能，在体内是一种极好的抗氧化剂和抗氧化损伤的细胞保护剂，其独特的抗氧化活性可避免器官移植期间的氧化，并且还可作为皮肤保护剂添加到化妆品中。

本研究探讨糙皮侧耳液体发酵培养的最佳条件，提高糙皮侧耳菌丝体中麦角硫因含量；糙皮侧耳发酵产麦角硫因对培养条件极为关键，通过评估不同生长天数、转速、培养摇瓶类型、装液量、培养温度，确定糙皮侧耳发酵产麦角硫因的最佳生长条件。实验结果表明，糙皮侧耳发酵产麦角硫因的最佳培养条件为：培养摇瓶为浅槽瓶，其麦角硫因含量为10.79mg/L；微粒直径为6mm，其麦角硫因含量为24.73mg/L；500mL三角瓶装液量为100mL，其麦角硫因含量为15.68mg/L；发酵周期为9天，其麦角硫因含量为23.75mg/L。在此条件下进行糙皮侧耳发酵可以获得最大麦角硫因含量。

关键词：麦角硫因 培养条件 液体培养 糙皮侧耳

Study on the production of ergothioneine by fermentation of Pleurotus ostreatus under different culture conditions

Abstract

Ergothioneine has multiple anti-inflammatory and anti-oxidant characteristics and is an significant active material in the body. It has many physiological functions, and wheat is an excellent antioxidant and oxidative damage cytoprotective agent in the body. In particular, its antioxidant activity can be used to avoid the possibility of organ oxidation during organ transplantation, and can also be added to cosmetics as a skin protectant.

In this study, the deep culture conditions of Pleurotus ostreatus liquid were studied to improve the content of ergothioneine in the mycelium of Pleurotus ostreatus. The fermentation of ergothioneine in the Pleurotus ostreatus was critical to the culture conditions. The growth days, rotation speed and flask type were evaluated by different growth days. , liquid volume, culture temperature, determine the optimal growth conditions for the production of ergothioneine in the fermentation of Pleurotus ostreatus. the experimental results indicate that the best culture conditions for the fermentation of ergothioneine in Pleurotus ostreatus were as follows: the culture shake flask was a shallow tank, the ergothioneine content was 10.79 mg/L; the particle diameter was 6 mm, and the ergothioneine content was 24.73mg/L; 500mL triangular bottle liquid volume is 100mL, its ergothioneine content is 15.68mg/L; fermentation cycle is 9 days, its ergothioneine content is 23.75mg/L. Under this condition, the maximum ergothioneine content can be obtained by fermentation of Pleurotus ostreatus.

Key Words: Ergothioneine; Culture conditions;Liquid culture; Pleurotus ostreatus

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 绪论 1

1.1 糙皮侧耳简介 1

1.1.1 糙皮侧耳概述 1

1.1.2 糙皮侧耳特征 1

1.1.3 糙皮侧耳分布 1

1.2 麦角硫因简介 2

1.2.1 麦角硫因概述 2

1.2.2 麦角硫因结构和性质 2

1.2.3 麦角硫因的生物合成 2

1.2.4 麦角硫因抗氧化作用 3

1.2.5 麦角硫因抗发炎作用 3

1.2.6 麦角硫因抗黑色素作用 3

1.2.7 其他 3

1.3 液体发酵 4

1.3.1 液体发酵简介 4

1.3.2 液体发酵的发展历程 4

1.3.3 液体发酵的优点 4

第二章 材料与方法 6

2.1 材料 6

2.1.1 菌种 6

2.1.2 试剂 6

2.1.3 培养液 6

2.1.4 主要仪器和设备 7

2.2 方法 7

2.2.1 菌种活化 7

2.2.2 种子培养液的制备 8

2.2.3 发酵培养液的制备 8

2.2.4 制片与镜检 8

2.3 培养条件 9

2.3.1 培养条件 9

2.3.2 生长天数 9

2.3.3 培养摇瓶类型 9

2.3.4 微粒直径 10

2.3.5 装液量 10

2.4 甘油消耗量测量 10

2.4.1 样品处理 10

2.4.2 标准品稀释 10

2.4.3 甘油测定 10

2.5 菌丝生物量测定 11

2.6 标准品的配置 11

2.6.1 标准品的配制 11

2.6.2 标准曲线的绘制 11

2.7 样品处理 11

2.7.1 样品处理 11

2.8 检测条件 12

2.8.1 检测条件 12

第三章 结论与讨论 13

3.1 甘油标准曲线 13

3.1.1 甘油标准曲线的绘制 13

3.2 麦角硫因标准曲线 13

3.2.1 麦角硫因标准曲线的绘制 13

3.3 培养条件探索结论 14

3.3.1 生长天数 14

3.3.2 培养摇瓶类型 15

3.3.3 微粒直径 17

3.3.4 装液量 18

3.4 讨论 20

第四章 前景与展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 绪论

1.1 糙皮侧耳简介

1.1.1 糙皮侧耳概述

糙皮侧耳，即平菇，其白变种有白玉、白雪、雪花菇，是一种常见的食用菇。最早种植于德国^[1]，但现时已在世界大范围种植。糙皮侧耳的外形跟杏鲍菇、珊瑚菇、凤尾菇与夏季鲍鱼菇等很相似。糙皮侧耳的水溶性多糖还具有体外抗氧化能力，其粗多糖对O₂^-、-OH具有清除作用^[2]。由于平菇的营养、药用和药理特性，已被用于传统医学。近年来对食用菌的研究显示了许多有趣的生物活性，包括抗肿瘤、抗癌，和抗氧化作用。糙皮侧耳含有许多次生代谢物，它们被证明是极好的抗氧化剂。

1.1.2 糙皮侧耳特征

菌盖表面簇新时污白色至深褐色，干后变为浅黄色至暗褐色，无环带，光滑；菌柄幼时和成熟后均为乳白色，柄长可达5cm，上部直径可达35mm^[3]。

糙皮侧耳的菌盖直径约50-200mm。有白色、褐色及蓝灰色。菌褶延生，通常是白色，附着在菌盖和茎上并且向下延伸。糙皮侧耳或扇形，通常2-10英寸（5-25cm）。通常生长在具有重叠簇的架状结构中，光滑，没有疣或鳞片。通常为白色至浅棕色，具有坚硬的白色果肉。干糙皮侧耳鉴定他们可能没有茎。如果蘑菇在原木一侧生长，它通常会粗短和偏离中心。如果它在顶部生长，你会看到一个更发达的茎，茎干周围没有环。

1.1.3 糙皮侧耳分布

糙皮侧耳分布于北京、河北、河南、黑龙江、吉林、辽宁、陕西、山西、山东、天津等省。

1.2 麦角硫因简介

1.2.1 麦角硫因概述

麦角硫因是一种真菌之代谢产物，其被发现存在于植物及动物组织中。麦角硫因在人体内无法被合成，仅能由食物来供应。对人类来说，麦角硫因主要是通过食用蘑菇和肉类来吸收的。麦角硫因具有有效的内在抗羟基、抗过氧和抗过氧亚硝酸盐自由基抗氧化活性^[4]，是一种重要的生理活性物质，可去除单线态氧，羟基自由基，次氯酸和氢过氧自由基，并对DNA进行解毒和维持DNA的生物合成，正常细胞生长和细胞免疫^{[5]-[6][7][8]}。麦角硫因分别在菌丝体和子实体中积累，其含量这取决于蘑菇的种类。

1.2.2 麦角硫因结构和性质

麦角硫因是一种发现于1909年的化合物^[9]-[10]，最初是从真菌Clavice pspurpurea中发现的。纯产物是白色晶体，水溶性，是一种无色、无味高水溶性氨基酸，不溶于非极性溶剂，一般在生理pH值下不会自氧化且在碱性环境下非常安定。从紫外光谱对pH和H₀的依赖性研究了麦角硫因的结构，这与一些模型化合物的相关性强烈表明麦角硫因以偶极甜菜碱的形式存在^[11]。

1.2.3 麦角硫因的生物合成

由于麦角硫因的高制造成本，它们的使用受到限制。目前，麦角硫因是通过化学合成，天然生物提取^[12]-[13]和生物合成^{[14]-[15][16][17][18][19]}三种方法制备的，与化学合成和天然生物提取相比，麦角硫因是通过建立高强度发酵过程对食用菌进行液体发酵而制成的。可以通过对发酵工艺的控制来改善麦角硫因产量，大幅提高生产率，减少生产成本，而且产品安全性高^[20]。由于麦角硫因的特殊结构，用化学合成麦角硫因十分困难。尽管OXIS公司用咪唑衍生物直接转化成咪唑-2-硫酮首次合成了左旋麦角硫因^[21]，但合成麦角硫因成本高，所以应用有限。麦角硫因可以从天然生物中提取，但性价比很低。和天然生物提取法相比，液体发酵合成麦角硫因有培养时间短、效益高、品质稳定、原材料来源广泛等优点。而且，生物合成生产麦角硫因产品的安全性比化学合成法更有保障。麦角硫因是一种天然的水溶性硫醇化合物，它通过有机阳离子转运蛋白OCTN1特异性地积聚在细胞中。在人类中，OCTN1和麦角硫因与自身免疫性疾病的发病机制有关^[22]。

1.2.4 麦角硫因抗氧化作用

研究表明，麦角硫因具有抗氧化作用^[23]。研究发现麦角硫因是HO·，ROO·及ONOO^- 强捕捉剂，并且可以捕捉单线态氧。麦角硫因可抑制过氧化氢在铁及铜离子存在下转化为羟自由基及保护细胞免于因过氧化氢诱导而造成细胞死亡。Akanmu D等人发现，体内特定浓度的麦角硫因可以作为抗氧化剂^[24]。

1.2.5 麦角硫因抗发炎作用

麦角硫因不仅是抗氧化剂，还是消炎剂。Rahman等人发现肺泡上皮细胞（A549细胞）中以TNF-α的处理显著增加了NF-κB的活化，但当A549细胞与TNF-α和麦角硫因一起培养时，则会抑制TNF-α诱导NF-κB之活化^[26]。该结果表明麦角硫因具有抗炎作用。Asahi T等人发现源自食用菌的麦角硫因在体外抑制髓过氧化物酶活性以及8-溴-2'-脱氧鸟苷的形成。麦角硫因的次氯酸和次溴酸清除作用高于抗坏血酸和谷胱甘肽。我们最初观察到，鸡腿菇的施用抑制了UV-B诱导的炎症反应和DNA卤化，表明麦角硫因是一种很有前途的蘑菇抗炎剂^[30]。

1.2.6 麦角硫因抗黑色素作用

国外有学者实验表明，左旋麦角硫因能有效抑制血细胞裂解物上清液中丙型肝炎病毒的激活。造血细胞中丙型肝炎病毒基因的转录物在经左旋麦角硫因处理的造血干细胞中表达较低。因此，在虾中添加麦角硫因是控制虾肌肉黑变病和脂质氧化的一种有希望的方法，蘑菇中的麦角硫因是一种潜在的抗黑色素和抗氧化化合物，用于控制水产虾的黑色素生成和脂质氧化^[25]。

1.2.7 其他

国外学者评估抗氧化剂L-麦角硫因对皮肤细胞紫外线损伤的影响，通过聚合酶链反应评估用U-VA照射并用L-麦角硫肽处理的人成纤维细胞中“共同缺失”的存在。已经证明，L-麦角硫因增强还原型谷胱甘肽的水平并保护细胞免于诱导光老化相关的mtDNA“常见缺失”。鉴于其结果，L-麦角硫因可能是一种有效的皮肤护理和88抗光老化成分^[31]。Aruoma OI等人发现通过天然抗氧化剂麦角硫因可以防止氧化损伤和细胞死亡。

1.3 液体发酵

1.3.1 液体发酵简介

液体培养是将微生物培养于液态培养基中，通过控制适当的pH值、温度、通氧量及搅拌速率等生长环境因素，使微生物在较适合的环境下培养。利用液体发酵培养菌菇类菌丝体有培养时间短、效益高、品质稳定、无重金属污染以及易于放大规模等优点，使其具有广阔的发展前景。改变液体发酵培养时培养基的组成与培养条件，在这些自然界不易存在的培养条件下，可以获得更多的发酵代谢产物。一般来说，平菇的固体培养需要很长时间来完成子实体，因此已经进行了许多尝试来从深层菌丝培养物中获得有用和有效的细胞或细胞外物质，用于营养制品和功能性食品的配制。液体培养产生了潜在的优势，即在紧凑的空间和较短的时间内菌丝产量更高，污染的可能性更小。

1.3.2 液体发酵的发展历程

在生物工程发展过程中，液体发酵技术逐渐成为一种重要的技术。早在1948年，弗吉尼亚大学的Elmer和Gaden的两位生物工程专家就在他们自己的生物反应器中进行了微生物细胞的液体深层发酵。同年，H.Humfeld通过液体发酵技术培养了蘑菇菌丝，他为美国食用菌发酵的发展奠定了基础。从那时起，许多生物学家开始研究液体发酵中食用菌和药用菌的培养，食用菌和药用菌的发酵引起了世界各国的关注，大规模的工业发酵已经开始^[27]。中国真菌液体发酵技术开始于1958年，随着众多中国科学家参与到液体发酵技术探索中，真菌和真菌分泌物的活性物质已广泛用于发酵产品的生产和制药工业中。

1.3.3 液体发酵的优点

一是原材料价格低廉、来源广泛，食用菌和药用菌的液体发酵技术采用的原料来源广和成本低；二是菌丝体生长迅速，液体发酵所用的培养基分布均匀。菌丝体与培养基的接触使得菌丝体能够完全吸收其中所含的营养物质，使得菌丝体生长更加旺盛，在短时间内大量生长分裂，产出许多目的产物；三是生产周期短，并且对于大规模生产和细菌生长，细胞生长周期从固体培养的30到60天缩短到大约2到7天。由于反应器产生的所有细胞都与培养基完全接触，菌丝基本上处于相同的年龄，这减少了发酵技术的工业生产限制；四是可以降低污染率，由于菌体和培养基之间的完全接触，细胞可以在高循环速率和短循环条件下生长，并且可以有效地避免细菌污染的可能性；五是工厂生产，无季节性限制，模拟的生长环境为细胞的大规模生产提供了巨大的空间^[28]。

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

2.1.2 试剂

表2-1 实验试剂

2.1.3 培养液

表2-2 培养液

2.1.4 主要仪器和设备

表2-3 实验仪器表

2.2 方法

2.2.1 菌种活化

从冰柜中拿出准备好的糙皮侧耳母种，室温放置待其融化，然后在TH-CB-型超净工作台中，用两点接种法，挑取1立方厘米的糙皮侧耳母种菌块，并快速转移至PDA固体培养基中，用电热恒温培养箱25℃培养10天，10天后选取菌丝体厚的，浅白色的，健康的，未污染的斜面试管备用。

2.2.2 种子培养液的制备

根据2.1.3中种子培养液配方制备培养基，将其置于500mL发酵摇瓶中，装液量均为100mL，瓶中放置10个直径为4mm的微粒，在高压灭菌锅121℃下灭菌20分钟。灭菌结束后，待其自然冷却至室温，放到超净工作台上并将与接种有关的设备在紫外光下灭菌15分钟。将2.2.1活化好的菌丝体倒入装有种子液培养基的三角瓶中，然后放置于组合式摇床中以25℃，150r/min振荡培养3天。

2.2.3 发酵培养液的制备

根据2.1.3中液体发酵培养液的配方配置培养基，将其置于500mL发酵摇瓶中，装液量为100mL，然后在高压灭菌锅中以121℃灭菌20分钟。灭菌结束后，使其自然冷却至室温，置于超净工作台上，并将所有接种相关设备在紫外光下灭菌15分钟。将种子液在已经灭菌过的超净工作台里接入5%种子液到发酵培养基中，然后在所要求的培养条件下培养至发酵结束，获得糙皮侧耳发酵液。

2.2.4 制片与镜检

用75%无水乙醇清洁载玻片，用移液枪往载玻片中央滴上一滴菌丝体，并合上盖玻片，用记号笔做好标记。用LeiCa DMC 2900显微镜观察菌丝体形态并保存图片。

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