1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1 概述

1.1丁二酸的性质

丁二酸，又称琥珀酸，分子式为C₄H₆O₄，分子量118.09，结构式为HOOC(CH₂)₂COOH。无色结晶体，味酸，可燃。熔点188℃，沸点235℃，相对密度1.572 g/cm³(25℃)，溶于水、微溶于醇、醚、酮类，几乎不溶于二硫化碳、苯、四氯化碳，不溶于氯仿、二氯化碳。^[1,2]丁二酸作为一种二元羧酸，加热到134.8℃时两个羧基可脱水生成丁二酸酐，分子式为C₄H₄O₃。25℃时水溶液中丁二酸可以解离为丁二酸根阴离子和质子，解离常数分别为K₁=6.52～6.65#215;10^-5，K₂=2.2～2.7#215;10^-8，0.1 mol/L水溶液的pH为2.7。

1.2 丁二酸的应用

丁二酸及其衍生物在食品、医药、农业、化工等领域中有重要用途，主要有以下四个市场：最大的市场是作为表面活性剂、清洁剂添加剂和起泡剂；第二是离子鳌合剂；第三个市场是食品行业中作为酸化剂、pH改良剂、风味物质和抗菌剂；第四个市场是和健康有关的产品，包括医药、抗生素、氨基酸和维生素的生产，市场总量每年超过四亿美元^[3]。但丁二酸真正的潜力是作为大规模工业原料的应用，替代苯和石油等大宗化工原料，其中以丁二酸为前体的C4大宗化学品1,4-丁二醇、四氢呋喃、g-丁内酯、N-甲基吡咯烷酮等的市场需求超过200亿元/年。制备新型可完全生物降解塑料聚丁二酸丁二醇酯（PBS）也将成为丁二酸的重要应用领域^{[4, 5]}。图1-1是以丁二酸为基础的化学制品。

最新的研究结果还表明丁二酸将在生物降解塑料的制备应用方面具有非常广阔的前景。将丁二酸与1, 4-丁二醇进行聚合反应可生成一类新型的生物降解塑料产品#8212;#8212;聚丁二酸丁二醇酯（PBS）^[6]。传统的脂肪族聚脂熔点较低因而不能单独用作塑料，PBS具有良好的热稳定性，并且其高分子量产品易得，又较同类的聚草酸酯具有优越的特性，因此在新一类生物降解塑料中备受青睐。丁二酸在生物降解塑料上的应用将成为今后其市场需求的一个新的激增点。

图1-1 以丁二酸为基础的化学制品路线图

Fig. 1-1 Map of routes to succinic acid-based chemical products

1.3 丁二酸的制备方法

1.3.1生产方法的介绍

（1）化学合成法

当前大部分的丁二酸都是通过化学法生产的，其中在工业生产上应用的方法主要有催化加氢法、石蜡氧化法、电化学合成法。将这三种方法总结如表1-1所示：

表1-1 化学法合成丁二酸的方法比较

（2）微生物发酵法

近年来发酵法生产丁二酸成为有机酸发酵研究的热门课题，以可再生的生物质能源玉米、木薯等基本原料预处理后得到糖液作为碳源，经微生物菌种厌氧发酵同时固定CO₂，发酵液再经过分离提取等步骤得到纯的丁二酸结晶产品。其中微生物发酵法生产丁二酸的主要工艺流程如图1-2所示。

图1-2 发酵法生产丁二酸的主要工艺流程

1.3.2 合成方法的比较

传统的化学法生产丁二酸成本高、污染大且依赖于石化资源，严重抑制了丁二酸作为大宗化学品的潜力，与化学合成法相比微生物发酵法生产丁二酸有诸多优点。

首先，发酵法的原料主要来自可再生资源如玉米、乳清等，它不仅能提供菌体生长所必须的碳水化合物而且能够提供廉价的氮源。这也将消除很大的环境污染，而且实现了资源的循环利用。

其次，上述微生物发酵生产工艺若再配以回收新工艺，预计丁二酸的成本比传统的化学生产法成本将大幅度降低，这就使发酵法生产的丁二酸为大量生产化学制品提供可能，它可以作为很多重要的中间产物和专业化学制品。作为一种商品化的化学制品，因为丁二酸的环境友好特性，成本的降低会有利于该产品取代很多基于苯和石化中间产物的商品，这可减少在超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产生的污染，并节约大量的能源，大大缓解现今社会的能源大量短缺的现象，减少煤等不可再生资源的消耗，社会和环境效益显著。

第三，由于发酵法生产丁二酸是以可再生糖源（如葡萄糖）和CO₂作为主要原料，因此新工艺本身不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且还开辟了温室气体CO₂利用的新途径^[10]。如果可以将丁二酸发酵和乙醇发酵过程整合在一起，不仅可以解决乙醇发酵的空气污染问题，同时也可以降低生产这两种有机物的成本^[7]。

1.4 基因工程大肠杆菌

丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间物。一般情况下，丙酸盐生产菌、典型的胃肠细菌以及瘤胃细菌能够分泌丁二酸。据报道，一些乳酸菌(LactobaciIlus)也能在特定的培养基上不同程度地产生丁二酸。国外在20世纪90年代就开始发酵生产丁二酸的研究， 目前报道的发酵产丁二酸的菌种主要Anaerobiospirillum succiniciproducens^[16]、Actinobacillus succinogenes^[17] 、Mannheimia succiniciproducens^[18]和重组E. coli^[19-21]，另外还有如Corynebacterium glutamicum、Mannheimia succiniciproducens^[22]由于天然菌株的产丁二酸能力非常低，发酵产物多种多样，对糖或丁二酸的耐受性比较差，因此必须运用生物工程技术对现有的菌种进行改造。^[23]

E.coli也能产生琥珀酸,但是野生型的E.coli菌株产琥珀酸的量很少。利用野生菌株生产琥珀酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。Escherichia coli具有遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产琥珀酸的优秀菌株。为了减少副产物的生成,提高琥珀酸的产量,需要采用基因工程技术改造菌株的代谢途径。美国阿贡国家实验室环境研究部研究者在大肠杆菌发酵生产琥珀酸领域进行了很多的研究。Millard等人通过在E.coli中过量表达PEP羧化酶,将琥珀酸产率从12%提高到45%(w/w)^[24]。为了不使碳源流向乙酸、乳酸、甲酸等副产物,通过基因工程技术获得ldh(编码乳酸脱氢酶)和pfl(编码丙酮酸一甲酸酶)的双缺失突变株E.coli NZN111,减少了副产物乳酸和甲酸的生成。但是在厌氧条件下,E.coliNZN111生长不佳并积累丙酮酸^[25-27]。

Donnelly等^[28,29]从E.coli NZN111 (ATCC 20201)出发,分离到一株自发突变株AFP111(△ptsG, △pflB, △ldhA),在厌氧条件下,该突变株可以在富含葡萄糖的培养基上生长,供给100%的CO2,发酵液中琥珀酸浓度可达45g/L,生产强度1.6 g/(L h),产率为99%(w/w),琥珀酸:乙酸:乙醇的摩尔比为2:1:1左右^[30]。

一般认为，野生型E.coli在有氧环境中，琥珀酸仅作为TCA循环的中间产物，没有积累；但在厌氧环境下，进行混合糖发酵^[31]（图1-3），利用木糖的ATP能量增加的话，就可以利用木糖及混合糖。

图1-3 大肠杆菌厌氧混合糖发酵产酸途径途径

Fig.1-3 Pathways of anaerobic mixed sugar fermentation for Escherichia coli

研究中以充分利用基因工程手段，以代谢工程的基本思路为背景，利用诱变技术，可以在厌氧条件下利用广泛的碳源,如树胶醛糖、纤维二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、甘露糖、山梨糖醇、蔗糖、木糖或水杨苷，本实验室有一株能利用木糖的菌株，但是其产量很低，目前文献报道用于琥珀酸生产的生物质原料很多，主要包括玉米秸秆、废糖蜜、麦秸秆等"我国是农业生产大国,其中玉米年产量仅次于美国,居世界第二位,玉米芯年产量近亿公斤,目前仅有效利用10一15%^[32]。这些玉米芯仅有很少一部分被用来生产糠醛、木糖醇等,大部分被焚烧掉或丢弃,所以充分利用玉米芯资源生产大宗生物基产品将是未来生物技术发展的一个重要方向"用玉米芯生产墟拍酸的研究很少,而且玉米芯中能够水解出大量的木糖，所以我们在增加菌株利用木糖的能力才能在以后更好的利用木质纤维素，结合传统发酵技术优化发酵过程，最终实现低原料，琥珀酸的高收率、高生产强度制备。

2 丁二酸生产菌株的筛选

2.1 常压室温等离子体诱变技术

常压室温等离子体（Atmosphere and Room Temperature Plasma，简称ARTP）是近几年来发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子（包括处于激发态的氦原子、氧原子、OH自由基等）浓度的等离子体射流。。可续研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁/膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，今儿使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。

采用氦气为工作气体的常压室温等离子体源中含有多种化学活性成分，如OH（A2 ，=0→X2#8217;=0,306-310nm）、氮分子二正系统（C3u-B3g）、氮分子一负系统（B2u-X2g）、激发态氮原子、氢原子和氧原子等。常压室温等离子体中的化学活性粒子成分能够使DNA等遗传物质的分子结构发生改变。该技术特点为：无需抽真空、无需高压电源、低温等离子体、等离子体射流更均匀、制备多样性突变库。

2.2 紫外线诱变育种

紫外线对微生物有诱变作用，主要引起DNA分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。

2.3 恒化器选育

恒化器选育是以一定的选择性压力为手段，利用菌体对环境的自适应机制，从细胞库中筛选出所需要的表型突变，使菌体选择性进化的方法^[33]。进化代谢是一种非常高效的菌株筛选方法，它在生物进化研究和菌株选育中具有广泛的应用。利用基因组学与进化代谢技术相结合的方法，可以直观地了解到变异菌体整个基因组的变化，在菌体适应性进化的动力学和基因学基础方面也获得了巨大的成功^[34-35]，这对于研究生物进化是一种里程碑式的突破。因为细菌具有数量大，传代速度快，并且可以适应一定环境的优点，因此对于可以适应选择性压力的菌体，能够快速地适应外界环境并达到稳定的生长状态，从而在进化代谢的过程中获得生长优势，对于那些不能快速适应环境的菌体，由于其生长速度慢，则很快被优势菌体淘汰^{[34, 36-37]}。进化代谢方法主要用于以下几个方面的菌株选育，一是选择能够抵抗某种底物或产物压力的高抗逆菌株，如改善产琥珀酸放线杆菌在琥珀酸生产中铵根离子的抑制^[38-39]，二是选择可以高效利用某些底物的菌株，如改善菌体对某些糖的利用效率^[40-44]。三是选育可以高效生产某一特定产物的菌体^[45-46]。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

需研究的问题：

1.进化代谢装置的搭建及其原理；

2.菌株的筛选方法及其突变菌株的传代稳定性问题；