文 献 综 述

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT,EC 2.3.2.2)可特异性地将 γ-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含γ-谷氨酰基的化合物。该反应包括了酶的酰基化(Acylation)和脱酰基化(Deacylation)两个步骤，通过改变受体种类，可制备一系列重要的谷氨酰化合物，如谷胱甘肽、谷胱二肽和茶氨酸等。

由于该过程位点特异性和光学选择性强，无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程中不消耗 ATP。因此，GGT 催化的谷氨酰基化反应已成为生物催化领域的研究热点。但在该酶的实际应用中却发现其热稳定性较差，在 55℃下 GGT 的酶活半衰期仅有 90 min。

酶的热失活是限制酶制剂工业生产和应用的重要因素，如何提高酶在工业环境下的稳定性是近年来生物化工领域研究的热点。目前，提高酶稳定性方法主要有：固定化法、化学修饰、基因工程技术、添加稳定剂法。固定化法、添加稳定剂法、化学修饰法已有相关研究发表^[2]。蛋白质的热稳定性是其所有共价和非共价结合力的综合体现，影响因素较多，包括疏水作用，氢键、盐键及共价键的稳定等，一般考虑降低折叠与非折叠的熵差，以减少非折叠的构象；通过残基替换稳定Ⅱ一螺旋及环等二级结构；增强疏水内核；增加残基间的氢键数。在基因工程领域，也有人做了定点突变提高里氏木霉木聚糖酶 (XYN II) 的稳定性的研究^[3]。从E. coli GGT 晶体结构的研究表明，GGT 是由大、小两个亚基组成的异源二聚体蛋白，酶分子中与供体结合密切关联的氨基酸残基，如 Arg-114N η、Ser-462O γ、Ser-463 N 和Ser-463O γ分别位于不同的亚基，亚基结构的稳定性是保证 GGT 活性的关键。而多亚基酶分子的热失活往往是由于亚基解聚造成的^[8-10]。所以，本课题以定点突变对γ-谷氨酰转肽酶的热稳定性的影响为研究目的,用定点突变使GGT外围的亲水氨基酸突变成疏水氨基酸，从而改变它的稳定性。

定点突变(site-directedmutagenesis)技术可以在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的特点;除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外,还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质。目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变法^[4]。本实验采用的是PCR介导的定点突变。

1．提高酶稳定性的方法

1.1 固定化法

根据固定酶材料与酶分子之间结合力的不同，可分为化学法和物理法。化学法又可分为交联法和共价结合法。交联法需要双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，从而把酶束缚在固体材料上。共价结合法是通过酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法。化学法所得的固定化酶与载体连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其它固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。物理法分为吸附法和包埋法。吸附法主要通过范德化力固定酶，把酶吸附在材料表面或内表面。包埋法将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化，适合小分子底物的催化反应。两种固定化方法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落并污染催化反应产物等^[1]。

1.2 化学修饰法

酶的化学修饰是通过主链的切割剪接和侧链基团的化学修饰对蛋白酶进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。酶结构与功能的研究可以通过修饰剂对酶的作用以及修饰部位来判断酶的结构。在工业方面能够提高产量，减少成本，而且减少对环境的污染。同时也存在一些局限性：（1）某种修饰剂对某一氨基酸侧链化学的修饰专一性是相对的，很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰；（2）化学修饰后酶的构象或多或少有一些改变；（3）酶的化学修饰只能在有极性的氨基酸上进行，而其它氨基酸侧链在维持空间构象方面也起着重要作用且从种属上分析，他们在进行中比较保守；（4）酶化学修饰的结果对于研究酶的结构和功能的关系提供一些关系，但缺乏准确性。