1.1 丁二酸及其研究的重要性

丁二酸（succinic acid），又名琥珀酸，分子式为C₄H₆O₄，是一种常见的天然有机酸，作为三羧酸循环还原端的终端产物，广泛存在于人体、动植物以及微生物中，在生物代谢中占有重要地位。丁二酸不仅可以作为添加剂应用于食品、医药等行业，同时亦可以作为C4平台化合物用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃等大宗化学品以及PBS（聚丁二酸丁二醇酯）等生物可降解材料。它可以取代很多基于苯和石化中间产物的商品。目前全球丁二酸产量为30,000-50,000吨，市场价格在每吨2400-3000美元，预计至2015市场需求将会达到100,000吨^[1]。

传统工业生产是采用氧化法、加氢法或电解氧化法生产丁二酸，以不可再生的战略资源石油产品作为原料的传统丁二酸生产方法导致了高价格和高污染，抑制了丁二酸作为一种优秀的化学平台产品的发展潜力^[2]。而发酵法生产丁二酸由于其高效率、环保性，以及原料的可持续性而受到一些研究工作者的推崇。生物法制备丁二酸以可再生生物质资源为原料，并可实现温室气体CO₂的固定，工艺过程具有绿色、能耗低、原子经济性高的优点，近年来成为国内外研究的热点^[3]。美国能源部2004年发布的报告中（www.eere.energy.gov/bimas- s/pdfs/35523) 将琥珀酸列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的第一位。

1.2 利用生物法制备丁二酸

目前利用生物法合成琥珀酸的主要菌种包括：Anaerobiospirillum succi- niciproducens、Actinobacillus succinogenes、Escherichia coli、Mannheimia succiniciproducens、Saccharomyces cerevisiae 、Corynebacterium glutamicum等^[2]。主要的研究方向分别从发酵菌株的筛选、不同碳源的利用、发酵过程控制以及相关途径的基因工程改造四个方面深入研究探讨。其中菌株的筛选主要通过物理、化学等诱变方式，提高野生菌株的产酸能力^[4]。碳源的利用主要围绕葡萄糖、蔗糖、甘油以及廉价的工业生产用碳源如糖蜜、玉米芯水解液等展开^[5]。发酵过程控制主要通过控制菌体生长、产酸不同阶段下的碳源补加方式、溶氧、pH、氧化还原势等发酵条件达到提高产量的目的^[6]。相关的代谢途径研究主要集中在糖酵解途径（EMP）、三羧酸循环(TCA)、回补途径以及乙醛酸循环上^[7]。

1.2.1 谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）的开发利用

尽管已有报道多种微生物可以发酵生产丁二酸，但被认为最有产业化前景的是C. glutamicum ^[8]。相较于产丁二酸放线菌和大肠杆菌，需要昂贵的有机氮源培养，C. glutamicum可以在简单无机培养基中生长良好，并且有大规模产业化先例（如谷氨酸、赖氨酸等）等背景，这在生产价格低廉的丁二酸工艺中，有明显的优势^[9]。在19世纪前，C. glutamicum用于氨基酸生产一般都是通过随机突变来筛选获得。随着基因工程技术的发展，研究人员在2002年完成了C. glutamicum ATCC 13032基因组全序列的测定与公布。基因组测序的完成为深入研究C. glu- tamicum基因结构及表达调控打开了方便之门，为进一步研究各个基因之间的相互关系提供了可能。

1.2.2 谷氨酸棒杆菌产丁二酸的研究现状

C. glutamicum作为高G C含量的革兰氏阳性菌，广泛存在土壤等自然环境中，作为氨基酸行业最主要生产菌株，在好氧状态下能够大量积累氨基酸。在厌氧条件下菌体不生长，但能维持一定的代谢能力，并没有氨基酸的积累。最近几年，科学家在厌氧条件下培养C. glutamicum发现其具有良好的有机酸生产潜力，主要积累乙酸，乳酸和丁二酸^[10]。丁二酸合成途径如图1-1所示，葡萄糖经糖酵解途经，通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或者丙酮酸羧化酶，进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸，最终以琥珀酸的形式积累。

为深入研究C. glutamicum厌氧条件下的代谢特性，日本科学家Masayuki Inuide等^[11]通过分别敲除代谢途径中关键酶基因，发现乳酸脱氢酶（LDH）突变株不产生乳酸，表明在C. glutamicum中这种酶不存在其他的同功酶。丙酮酸羧化酶（pyc）的缺失并未影响菌体厌氧产酸的能力，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）突变株相较于野生型，其丁二酸产量的显著降低，同时伴随着乳酸量和葡萄糖消耗率速率的下降。这些发现证实了ppc基因在驱动回补途径合成丁二酸中的重要作用。然而在Δldh突变株中分别过表达ppc和pyc基因，结果却相反，过表达ppc基因并未提高丁二酸产量，而过表达pyc基因相较于宿主菌提高了近两倍。Okino等^[12]通过失活C.glutamicum中乳酸脱氢酶(ldhA)并导入丙酮酸羧化酶（pyc）基因，丁二酸产量达到146 g/L，副产物乙酸产量达到16 g/L，葡萄糖对丁二酸的转化率为1.4 mol/mol，丁二酸收率和产率分别达到92%，3.2 g.L^-1.h^-1。