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摘 要

NADH 氧化酶是一类催化NADH 氧化为NAD 并消耗氧气的氧化还原酶, 因其能够再生NAD 成为人工调控微生物代谢流向的重要调控酶。NOX在氧化态辅酶再生方面具有巨大的应用潜力。大部分氧化还原酶的催化反应需要辅酶NAD(P) 和NAD(P)H作为氧化剂或还原剂参与，由于氧化还原酶应用广泛且辅酶价格昂贵，使得辅酶再生逐渐成为研究热点。而为了实现工业化生产，游离的NADH氧化酶无法满足条件，因此，采用交联酶聚集体技术将酶固定化，可以实现NADH氧化酶的重复利用以及降低生产成本。

本课题研究的是NADH氧化酶聚集体的构建及其性质研究，将细致的描述NADH氧化酶CLEAs的性质及应用。实验结果表明，酶浓度、交联时间、交联温度、交联剂的浓度、沉淀剂的种类对交联酶聚集体的制备都有很大的影响。通过正交实验，选择出最优制备条件，确定使用60%的硫酸铵饱和溶液进行沉淀，交联剂戊二醛浓度为10 mM，交联温度为20℃，酶浓度为8 mg/ml，交联时间为30 min，使用上述条件制备出最优回收率的固定化酶。对于制得的NADH氧化酶CLEAs经过酶学性质研究及动力学参数的测定得到结果显示，NADH氧化酶CLEAs的最适pH相较于游离酶向酸性方向平移了1个单位，同时固定化酶的pH稳定性得到了大幅提高。与此同时，CLEAs的最适温度和游离酶相比没有发生变化，不过温度稳定性上固定化酶有小幅提高。固定化酶对底物辅酶NADH的Km值为0.11 mM，最大反应速率为2.81 mM/min。利用NADH氧化酶CLEAs结合葡萄糖脱氢酶催化反应葡萄糖，重复催化反应5次仍保持50%的催化活力。

关键词：NADH氧化酶 交联NADH氧化酶聚集体 酶学性质 重复利用

Crosslinking NADH oxidase system structure and its properties

Abstract

NADH oxidase is a kind of catalytic oxidation of NADH NAD and consume oxygen oxidoreductase, because its will become a artificial regeneration of NAD control flow of important microbial metabolism regulatory enzymes. NOX in oxidation state coenzyme regeneration has great application potential. Most REDOX enzyme catalytic reaction needed coenzymes NAD (P) and NAD (P) H as oxidants or reducing agent to participate in, has been widely applied because of oxidoreductase and coenzyme is expensive, make coenzyme regeneration gradually become a hot research topic. In order to realize industrialized production, and free of NADH oxidase cannot meet the conditions, therefore, using crosslinked enzyme aggregates to enzyme immobilization technology, can realize the reuse of NADH oxidase, and reduce the production cost. This topic is the study of the construction of aggregate and its properties, NADH oxidase will detailed describe the properties and application of NADH oxidase CLEAs.

Keywords: NADH oxidase; Crosslinking NADH oxidase aggregates; Enzymology properties; Repeated use

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 NADH氧化酶概述 1

1.1.1 NADH氧化酶的来源及分类 1

1.1.2 NADH氧化酶的反应机制和生理作用研究 1

1.1.3 NADH氧化酶的应用 2

1.1.4 体外构建酶偶联反应辅酶再生体系 2

1.2 交联酶聚集体技术的研究进展 2

1.3本论文的研究意义和主要研究内容 5

1.3.1 立题意义 5

1.3.2 本论文的主要研究内容 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1 引言 7

2.2 实验材料和设备 8

2.2.1 主要试剂 8

2.2.2 主要仪器 8

2.3 实验方法 9

2.3.1 交联NADH氧化酶聚集的制备方法 9

2.3.2 NADH氧化酶活力的测定方法 9

2.3.3 交联NADH氧化酶聚集体制备条件的选择 10

2.4 NADH氧化酶聚集体酶学性质的研究 11

2.4.1 CLEAs最适pH的研究 11

2.4.2 CLEAs pH稳定性的研究 11

2.4.3 CLEAs最适温度的研究 11

2.4.4 CLEAs热稳定性的研究 12

2.4.5 CLEAs 动力学参数的研究 12

2.4.5 NADH氧化酶CLEAs重复利用研究 12

第三章 实验结果与讨论 13

3.1 不同种类沉淀剂的影响 13

3.2 不同NADH氧化酶浓度的影响 13

3.3 不同交联时间的影响 14

3.4 不同交联剂浓度的影响 15

3.5 不同交联温度的影响 15

3.6 正交试验优化制备工艺参数 16

3.7 CLEAs最适pH的研究 17

3.8 CLEAs的pH稳定性研究 17

3.9 CLEAs最适温度的研究 18

3.10 CLEAs热稳定性的研究 19

3.11 CLEAs动力学参数的研究 20

3.12 NADH氧化酶CLEAs重复利用研究 20

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致 谢 26

第一章 文献综述

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