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摘 要

本研究采用含有两个强启动子（PGK1 和TEF1）的组成型酿酒酵母穿梭质粒pESC-LEUD ，成功构建重组酵母YPH499(pESCD-DUGT)， 实现甜叶菊糖基转移酶UGT76G1在一种载体上双启动子共表达。考察了该重组菌的生长与产酶情况，测得菌生长12h时，酶比活最高为55.54434mU/mg，重组酶的活力在生长中期最高，之后随培养时间的增加而降低。对全细胞催化生成RA 甙的反应体系初步研究，在葡萄糖40 g/L、St 甙4 g/L、MgCl₂ 0 g/L、柠檬酸钠15 g/L、1%甲苯（通透剂）、pH 8.0、25 °C 的反应条件下，总OD为1000的细胞催化50 h，RA 甙的产量可达3326.3 mg/L。

关键词：甜菊甙 莱鲍迪甙A 甜菊甙糖基转移酶UGT76G1 双启动子共表达 酿酒酵母 全细胞催化

Constitutive Expression of Glycosyl-transferase UGT76G1 in Saccharomyces cerevisiae and Biocatalysis for production of Rebaudioside A

ABSTRACT

A modified shuttle expression vector of the pESC-LEUD in S. cerevisiae was used, which contains the two constitutive promoters, pPGK1 and pTEF1, providing the possibility of expressing two Glycosyltransferase UGT76G1 genes at the same time from a single vector. And the Saccharomyces cerevisiae strain YPH499 with the vector of pESCD-DUGT was constructed. Then investigated the relationship of the growth and the protein of recombinant strains. The results confirmed that the highest expression of the recombinant protein was observed when cultured for 12h in SD-L, the specific activity is 55.54434mU/mg. With consumption of glucose in SD-L, the glucosyltransferase activity is decreased with the extension of incubation time.

A whole cell catalysis method was established with toluene 1% used as appropriate cell surfactant. The conditions for the whole cell catalysis system were investigated as follows: stevioside 2 g/L, glucose 40 g/L,, MgCl₂ 0 g/L, citric acid sodium 15 g/L, the pH of phosphate salt solution 8.0, the reaction temperature 25 ℃, the reaction time 48 h. Under the above conditions, with the total OD 1000 of cells, the yeild of rebaudioside A can reach 3326.3 mg/L.

KEYWORDS: Stevioside； Rebaudioside A；Glycosyl-transferaseUGT76G1；Cloning and expression ; Saccharomyces cerevisiae；Whole cell catalysis

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

目录 III

第一章　　文献综述 1

1.1 　背景 1

1.2 莱鲍迪甙A生产制备方法 3

1.2.1 化学转化法 3

1.2.2分离提纯工艺 3

1.2.3 酶促修饰法 3

1.2.4 微生物转化法 3

1.3 甜菊糖甙的生物合成研究现状 4

1.4 酿酒酵母表达系统 5

1.5 微生物细胞内糖基供体UDPG 6

1.6 立题意义 7

1.7 本论文的研究内容 7

第二章 　pESCD-DUGT质粒在酿酒酵母的组成型表达及其全细胞催化合成RA 8

2.1 前言 8

2.2 实验材料 8

2.2.1 实验仪器 8

2.2.2 菌株与质粒 9

2.2.3 试剂和试剂盒 10

2.2.4 实验试剂 10

2.2.5 菌株与培养基 11

2.3 实验方法 12

2.3.1 目的基因的获取 12

2.3.2 表达载体pESCD-DUGT的构建及鉴定 13

2.3.3重组酶UGT76G1的表达及粗酶液的制备 14

2.3.5 全细胞催化合成莱鲍迪甙A反应体系的建立 15

2.4 结果与讨论 16

2.4.1 PCR 扩增UGT 片段 16

2.4.2 重组质粒的酶切鉴定 16

2.4.3 莱鲍迪甙A的标准曲线 17

2.4.4 莱鲍迪甙A的HPLC测定方法 18

2.4.5 重组菌与对照菌粗酶催化能力比较 19

2.4.6 重组菌YPH499(pESCD-DUGT)的菌龄对粗酶活力的影响 19

2.4.7 全细胞催化合成莱鲍迪甙A 20

2.5本章小结 20

第三章 结论与展望 22

3.1结论 22

3.2展望 22

参考文献 23

致 谢 28

第一章　　文献综述

1.1 　背景

从菊科植物甜叶菊叶片中提取到的纯天然甜味剂甜菊糖，别称甜菊糖甙、甜菊苷或甜菊精，甜度大约是蔗糖的 200到300 倍之间。甜菊糖不能进入人体代谢途径，不会停留或生成其它物质，也不会产生代谢热 ^[1]。美国国立癌症研究所确认其为“非致癌物质”，我国多项毒性试验也证明它是安全无毒的甜味剂。除此之外，也相关研究表明，甜菊糖可在一定程度上减缓或避免肥胖症、心脏病、消化道溃疡、动脉硬化和高血压等病症的发生，并可防止龋齿的发生^[2,3]，因此甜菊糖作为一种健康的新糖源，是最理想的蔗糖替代品，市场应用前景广阔。目前，我国作为世界上生产和出口甜菊糖最大的国家^[4]，但目前市售的甜菊糖存在重大缺陷，在口感上有较强余苦味，极大降低了其市场价值，因而如何改进甜菊糖的味质显得尤为重要。

甜菊糖为四环二萜糖苷类天然产物，到目前为止，结构已知的糖甙共10 种，其结构通式见图1-1。每种糖甙具有相同的甙元结构——甜菊醇，不同之处在于C19 和C13位上连接数目不同的葡糖基和鼠李糖基 ^{[5, 6]}。甜菊糖甙化学性质稳定^[4,7]，主要用途是替代蔗糖、高果糖浆、结晶果糖等甜味剂用于食品增甜^[3]，在饮料、乳品、糖块、点心等食品行业中应用广泛^[8]。

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