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摘 要

羰基还原酶是广泛存在于各种生物体内的酶系总称。是重要的生物催化剂，能将潜手性的底物转化成具有手性的重要医药中间体。研究发现羰基还原酶利用辅酶NADH或NADP，通过和底物氯酮反应可生成氯醇，而氯醇则是合成阿扎那韦的主要原料。而阿扎那韦是有效抑制艾滋病的药物，这引起研究人员的高度重视。实验通过对该酶的研究，得到了影响该酶的酶活因素：发酵液浓度高的酶活大；温度在37℃时酶活最高；底物浓度苯乙酮相对于酶活的影响则是随着浓度升高，酶活越大。在通过高效液相色谱法测酶催化的转化率，采用控制变量法，保证在其他条件都不变的情况，研究影响酶催化反应的因素：不同酶液的制备方法也会对酶催化反应产生影响；随着反应时间越长，酶在48h催化合成率最高；辅酶能明显提高酶催化的反应，而没有添加辅酶则效率很低，说明羰基还原酶的还原与氧化反应依赖于辅酶。有两种类型不同的辅酶，其中NAD(H)和NADP(H)是最为常见的。由结果可知，此酶对NAD的亲和性更高。

关键词：羰基还原酶 立体选择性 酶学性质 (2S,3R)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-4-苯基-2-丁醇

Study on the enzymatic properties of the carbonyl reductase LV507 for preparation of chlorinated alcohols

ABSTRACT

Carbonyl reductase is a general term for enzymes in various organisms. It is an important biological catalyst that can convert the potential chiral substrate into a chiral important pharmaceutical intermediate.The study found that the carbonyl reductase by NADH or NADP and substrate chloromethyl ketone reaction can generate chlorine alcohol and epichlorohydrin is the main raw material for synthesis of atazanavir.Atazanavi is the effective drug to inhibit the AIDS, which caused the attention of researchers.The activity of the enzyme was studied by the enzyme:The activity of the enzyme activity of high concentration of the fermentation liquid was high, the enzyme activity was the highest when temperature was 37, and the activity of the substrate concentration of benzene to the enzyme activity was higher than that of the enzyme activity.The conversion of enzyme catalyzed by HPLC was determined by using the method of controlling variables and the other conditions were guaranteed,I study the factors that affected the enzyme catalytic reaction: the preparation method of different enzyme liquid also can have an effect on the catalytic reaction of enzyme;With the longer reaction time, The highest rate of the enzyme was synthesized in 48H; coenzyme can significantly improve the enzyme catalyzed reaction, without adding coenzyme, efficiency is very low, indicating that the carbonyl reductase and redox reaction depends on the coenzyme.There are two types of coenzyme, in which NAD (H) and NADP (H) are the most common. From the results, the affinity of the enzyme to NAD was higher.

Keywords:carbonyl reductase; stereoselectivity ;enzymatic properties; (2S, 3R) - N - (TERT butoxycarbonyl - 3 - amino - chloro - 4 - phenyl - 2 - butanol

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 前言 1

1.1 羰基还原酶 1

1.1.1 羰基还原酶的研究进展 1

1.1.2 羰基还原酶羰基还原酶在不对称还原反应中的应用 2

1.1.3 羰基还原酶的催化机理 2

1.1.4 羰基还原酶生物催化的优点 3

1.2 氯醇的简介 3

1.3 本文思路 4

第二章 实验材料 5

2.1 实验仪器 5

2.2 实验药品 5

第三章 实验方法 7

3.1 酶活检测的方法 7

3.2.1 pH8.5三乙醇胺-盐酸缓冲液配制 7

3.2.2发酵液直接制备的酶液 8

3.2.3发酵液经膜浓缩后制备的酶液 8

3.2.4发酵液经膜浓缩及离心后菌体制备的酶液 8

3.3 酶催化反应 8

3.4分析方法 9

第四章 结果与讨论 10

4.1发酵液浓度对于酶活的影响 10

4.2温度对于酶活的影响 10

4.3不同苯乙酮浓度对于酶活的影响 11

4.4不同酶液的制备方法对酶催化合成的影响 11

4.5反应时间对于酶催化合成的影响 12

4.6有无辅酶对酶催化合成的影响 12

4.7辅酶种类对酶催化反应的影响 13

第五章 结论与展望 15

5.1 结论 15

5.2 展望 15

参考文献 16

致 谢 17

第一章 前言

1.1 羰基还原酶^[1]

根据文献得知，羰基还原酶主要分为以下几类：短链脱氢酶/还原酶家族(short-chain dehydrogenases/reduetases，SDR)、中链脱氢酶/还原酶家族(medium-ehaindehy drogenase/reduetase，MDR)和醛酮还原酶家族(aldo-keto reduetasesuper family，AKR)等。SDR是非金属氧化还原酶，含保守催化序列Tyr-X-X-X-Lys以及和NAD(P)H结合的Rossmann折叠GGG-X-G-X-G，一般是27kDa的二聚体或四聚体蛋白，含大约260个氨基酸。而AKRs是一类NADPH依赖的单体蛋白，分子量在35-40kDa，含大约350个氨基酸，不含Rossmalin折叠。CRs的序列一致性较低，仅为15-30%，但它们有着相似的三级结构。

羰基还原酶的来源十分广泛，在自然界的生物中普遍存在，在不同生物中都已经证实能够分离出各种羰基还原酶。其中，由于微生物其广泛的生物多样性，以及培养周期短、催化效率高、环境污染少等优点，成为不对称合成中羰基还原酶的主要来源^[2]。酿酒酵母(Saccharomyce cerevisiae)是生物催化酮还原对的微生物，由于价格便也很容易获得，所以得到广泛的研究。除此之外，还有木兰假丝酵母candida magnolia、树干毕赤酵母PichiastiPitis、近平滑假丝酵母Candida Parapsilosis、赤红球菌Rhodococcus ruber、克菲尔乳杆菌Lactobacillu kefir白地霉Geotrichum candidum等，这些菌种中蕴含丰富的催化剂资源，在自然界中易取得。另外，一些光合微生物如细长聚球藻Synechococcus elongates等，可以通过自身的光合作用将光能转化为化学能(NAD(P)H)，在辅酶再生方面提供了模板，成为科学家们研究的热点。

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