论文总字数：18911字

摘 要

(S)-4-氯-3-羟基-丁酸乙酯（(S)-CHBE）不仅是他汀类药物中极其重要的手性砌块，而且还是重要的瓶颈化合物，市场需求极大，已然成为当前生物催化与转化领域研究的热门话题。本研究通过双酶耦联的辅酶循环系统的建立和以山梨醇为辅助底物的底物耦合辅酶循环系统的建立，考察了单相体系以及水/有机相双向体系中不对称合(S)-CHBE的研究。在水相中，重组菌BL21/pet-FabG-GDH催化150 mM COBE的转化率为80%；在双相（甲苯）中，重组菌BL21/pet-FabG-GDH可以催化500 mM COBE，转化率达到86%，ee值为99%。经过反应条件优化后，以山梨醇为辅助底物，山梨醇与COBE的摩尔比为1.2，乙酸丁酯为有机相，0.3 mM 的NADP ，0.14 g/ml的细胞菌体(湿重)，反应24 h，重组菌BL21/pet-FabG可以将3 M的COBE完全转化，ee值为99%。

关键词： 羰基还原酶；不对称还原；两相体系；(S)-CHBE ；辅酶再生

Preparation of (S) -4- chloride -3- Hydroxybutyrate by asymmetric reduction of COBE with recombinant Escherichia coli cells

Abstract

(S) -CHBE as the most important chiral block and bottleneck compound for statins, the market demand is great, and it has become a hot research in the field of bio catalysis and transformation. This work focused on establishing the double enzyme-coupled coenzyme circulatory system and using sorbitol as co-substrate for the coenzyme circulatory. Effects of single-phase systems and water / organic phase bidirectional were evaluated for the asymmetric reduction of COBE for (S) -CHBE production. In the aqueous phase, the conversion rate for 150 mM COBE was 80%; in the two-phase reaction system(toluene), the conversion rate for 500 mM COBE could reach 86%, with ee value 99%. After optimization of the reaction conditions, sorbitol as co-substrate, the ratio of sorbitol / COBE was 1.2, butyl acetate as organic phase, 0.3 mM of NADP and 0.14 g / ml of bacterial cells (wet weight), reaction 24 h, 3 M COBE could convert to (S) -CHBE completely, with ee value of 99%.

Key Words: Carbonyl reductase ; asymmetric reduction ; two-phase system ;

(S)-CHBE ; coenzyme regeneration

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 (S)-4-氯-3羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的用途和市场前景 1

1.1.1 手性药物 1

1.1.2 (S)-CHBE的作用机理和市场前景 1

1.2 羰基还原酶不对称合成(S)-CHBE 2

1.2.1 羰基还原酶 2

1.2.2 辅酶再生 2

1.3 国内外高效制备合成(S)-CHBE的研究现状 3

1.4 本课题研究目的研究 4

1.4.1 本课题的研究目的 4

1.4.2 研究内容 4

第二章 材料与方法 6

2.1 实验器材 6

2.2 实验试剂 6

2.3 菌株和培养基 7

2.4 试验方法 7

2.4.1 重组菌BL21/pet-FabG和重组菌BL21/pet-FabG-GDH的诱导表达 7

2.4.2 表达产物的SDS-PAGE分析 7

2.4.3 酶活测定 9

2.4.4 重组菌BL21/pet-FabG-GDH不对称合成(S)-CHBE的研究 9

2.4.5重组菌BL21/pet-FabG不对称合成(S)-CHBE的研究 9

第三章 数据分析与实验结论 11

3.1 SDS-PAGE检测目的蛋白的表达 11

3.2 酶活的测定 11

3.3 重组菌BL21/pet-FabG-GDH不对称合成(S)-CHBE的研究 12

3.4 重组菌BL21/pet-FabG不对称合成(S)-CHBE的研究 13

3.4.1有机试剂的选择 13

3.4.2 底物COBE上载量的研究 14

3.4.3 不同山梨醇浓度对生物催化的影响 14

3.4.4 不同浓度辅酶NADP 对生物催化的影响 15

第四章 结论 17

参考文献 18

致谢 21

第一章 文献综述

1.1 (S)-4-氯-3羟基-丁酸乙酯((S)-CHBE)的用途和市场前景

1.1.1 手性药物

手性(chirality)是生物系统的基本特征。就像人的左右手一样，手性是指一种物体不能与其镜像叠合的非对称特点，所以名为手性。自然界存在着许多手性化合物，这些化合物都具有R-型或S-型，这两种对映异构体。手性包含很多方面，不仅是包含氨基酸、碳水化合物、脂肪这些构成机体的元素，而且参与代谢的酶，受体和细胞表面参与代谢和调节有机体也都是手性的^{[ 1;2]}。不同的环境对对映异构体的影响不同，因此由于环境的变化，对映异构体所表现的性质也有所不同。例如在手性环境中，化学，药理和生物性质就会有不同的表现，相反在非手性环境中就不会出现这种现象^{[ 3;4]}。

当一对带有手性的分子被进入人体中的手性环境时，不同的手性物质就会有不同的生物活性、药理和毒副作用。在国际上，大家对于手性和手性药物的研究正在不断深入，手性科学不断发展，因此推动了手性药物的发展。也推动了我国手性药物的工业化的发展。

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