论文总字数：17820字

摘 要

本论文主要是研究海泡石作为载体，经过-氨丙基三乙氧基硅烷（KH550）有机改性后固载猪胰脂肪酶，并对脂肪酶的酶学性质进行了研究。

经过有机改性的海泡石加入交联剂戊二醛，戊二醛与酶蛋白中的游离氨基发生希夫碱反应，使酶固定在海泡石上。论文对其固载条件进行了优化：

在室温下，40 mL浓度为2 mg/mL的酶液，加入一定量的经0.4%浓度戊二醛处理的KH550改性的海泡石，磷酸盐溶液pH为6.5，在经过3 h的固载时间，酶活达到最大。并且发现在经过固载条件优化后的固定化脂肪酶，其可重复利用性和储存稳定性都有明显的提高。本文所制的固定化酶在经过7次重复使用后，仍保留了约为80%的活力；固定化酶在4℃条件下储存放置16天后，固定化酶的活性仍保持在最初活性的70%以上。

关键词：海泡石；猪胰脂肪酶；固定化；-氨丙基三乙氧基硅烷

Study on Immobilization of Lipase onto Modified Sepiolite and Properties of PPL

Abstract

In this work, porcine pancreatic lipase (PPL) was immobilized on sepiolite modified by γ-aminopropyl triethoxy silane, and its enzymatic properties were explored.

Porcine pancreatic lipase was then immobilized on the above mentioned carrier γ-aminopropyl triethoxy silane modified sepiolite through cross-linking reaction with glutaraldehyde which reaction with free-amino. The optimized immobilization condition was as follows:

Certain quality of sepiolite modified by glutaraldehyde-activated γ-aminopropyl triethoxy silane was added to 40 mL enzyme solution in phosphate buffer pH 6.5, with a protein content of 2 mg/mL. The cross-linking process was performed over 3 h. The activity of immobilized PPL reached the best. Results show that immobilized PPL has much better activity over wider ranges of reusability and storage stability than those of the free enzyme. The immobilized enzyme retained 80% initial activity after 7 cycles of reused operation. After 16 days storage in condition of 4℃, The immobilized enzyme retained 70% initial activity.

Key Words: Sepiolite; Porcine pancreatic lipase; Immobilization; γ-aminopropyl triethoxy silane

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 脂肪酶的性质概述 1

1.1.1 脂肪酶的简介 1

1.1.2 脂肪酶的催化机理 1

1.2 固定化酶 3

1.2.1 游离酶与固定化酶 3

1.2.2 固定化酶的制备方法 3

1.2.3脂肪酶固定化的意义 5

1.3 新型固定化载体——海泡石 5

1.3.1 固载材料 5

1.3.2 海泡石介绍 6

1.3.3 海泡石的主要性能 7

1.4 立题研究意义及其前景 7

第二章 海泡石有机改性吸附固定化猪胰脂肪酶 8

2.1 引言 8

2.1.1 实验试剂 8

2.1.2 实验仪器 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 海泡石的提纯 9

2.2.2 海泡石的有机改性 9

2.2.3 固定化脂肪酶 10

2.2.4 脂肪酶活力的测定 10

2.2.5 酶蛋白含量的测定 11

2.3表征分析方式 12

2.4酶固定化过程优化 12

2.5 酶学性质研究 12

第三章 结果分析与讨论 13

3.1表征分析 13

3.1.1扫描电子显微镜（SEM）分析 13

3.1.2红外光谱（FT-IR）分析 14

3.2固定化条件的优化确定 15

3.2.1固定化时间的影响 15

3.2.2 pH对固定化酶的影响 16

3.2.3戊二醛浓度的影响 17

3.3酶学性质研究 18

3.3.1固定化酶的可重复利用性 18

3.3.2固定化酶的储存稳定性 19

3.4本章小结 19

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 脂肪酶的性质概述

1.1.1 脂肪酶的简介

脂肪酶^[1]是一种被广泛使用于各种不同的催化反应中的十分重要的酶。作为人类最早探究的酶类之一，来源大多从植物、动物肝脏以及微生物中获取。由于存在于微生物中的脂肪酶种类较多，不管是在水解还是合成反应中所具有的催化活性以及拥有的更为广泛作用的pH值和温度范围，使其已在化学工业以及制药方面得到广泛应用。脂肪酶能够水解甘油和脂肪酸所构成的酯键，催化反应方程式如下：

（1-1）

近几十年来，界面酶学和非水酶学的研究以及后期的实践应用获得了突破性进展，极大地促进了脂肪酶多功能催化作用的开发。脂肪酶作为生物催化剂，即使在有机溶剂等不利条件下也能保持其高度活性，并且由于其易提供、低成本和在有机合成中的巨大利用价值而被广泛利用。

1.1.2 脂肪酶的催化机理

脂肪酶催化机理，即“界面活化”机理，相比其他类水解酶，脂肪酶在水/油界面上可表现出高的催化活性^[2,3]，而这和脂肪酶的构象密不可分。在大多数情况下，脂肪酶上有一个或两个短-螺旋通过二硫桥连接脂肪酶，这个部分是可移动的，我们称其为“盖子”结构。“盖子”的内表面是相对疏水的，而外表面是相对亲水的。当脂肪酶处于水溶液中时，盖子处于闭合状态，脂肪酶为不活泼的状态；当脂肪酶在油/水界面中时，酶的空间构象由于界面能的关系而发生变化，此时“盖子”打开，酶的活性中心被暴露出来，底物易于与活性中心结合。图1-1表现的则是脂肪酶在“盖子”闭合和打开时两种不同的构型图^[4]。

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