论文总字数：17680字

摘 要

代谢组学是通过高灵敏度、高通量、高分辨率的现代仪器分析方法，对细胞、体液、组织中所有代谢物进行无偏向的定性与定量分析的一门学科。本论文以Glarea lozoyensis为研究对象，发酵产生纽莫康定B₀，利用代谢组学技术了解由于培养基含量不同而导致胞内代谢产物的改变，还有研究不同的淬灭方式对G. lozoyensis代谢物收集的影响，为发酵工艺的优化提供更好的方向。

通过对G. lozoyensis 发酵条件的初步优化，最终发酵条件为：种子培养阶段培养5天、发酵培养接种量为10%、发酵培养阶段的碳源替换为单一碳源甘露醇以及发酵培养阶段初始甘露醇浓度为80 g/L，最终15天发酵产量为1470 mg/L。

基于GC-MS对代谢产物的分析，优化了淬灭条件。得出了60mmol/l 的HEPES缓冲条件下-80 ℃提取3 min可以达到最佳效果。

关键词：Glarea lozoyensis 代谢组学 培养基 淬灭

Abstract

Metabonomics is based on modern analytic technique with high throughput, high sensitivity,and high resolution,which involves the unbiased quantitative and qualitative analysis of the complete set of metabolites present in cells, body fluids and tissues. This thesis takes Glarea lozoyensis as the object of study,which can produces PneumocandinB₀,by using the metabolic technology to understand the changes of intracellular metabolites caused by different medium contents.The effect of different quenching and extraction methods on the metabolites were also studied. Provide better direction for the further optimization of fermentation process.

Optimization of the fermentation conditions of G. Lozoyensis,The final fermentation conditions were：Seed culture stage 5 days、the amount of fermentation culture was 10%、the carbon source of the fermentation stage was replaced by single carbon source mannitol and the initial mannitol concentration of the fermentation stage was 80 g/L,The final 15 days fermentation output was 1470 mg/L.

Analysis of metabolites based on GC-MS,which optimized quenching conditions.

The optimal effect was obtained by extracting it under the 60mmol/l HEPES buffer of -80 ℃,and 3 min .

KEYWORDS: Glarea lozoyensis;Metabolomics;culture medium;quenching.

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 纽莫康定B₀简介 1

1.1.1 棘白菌素类抗生素 1

1.1.2 纽莫康定B₀——抗真菌药物卡泊芬净的前体 1

1.2微生物代谢组学的研究方法与进展 2

1.2.1 代谢组学的介绍 2

1.2.2 微生物代谢组学的研究技术方法 2

1.2.3 微生物的培养 3

1.2.4 快速取样与代谢淬灭 3

1.2.5 胞内代谢物的提取 4

1.2.6 代谢物的分析平台 4

1.3代谢组学在微生物领域的研究进展 5

1.4 本论文研究的主要内容及意义 6

1.4.1 本论文的主要内容 6

1.4.2 本论文的研究意义 6

第二章 实验材料 7

2.1 菌株来源 7

2.2 实验器材 7

2.3实验试剂 8

第三章 实验方法 9

3.1发酵方法 9

3.1.1 培养基 9

3.1.2培养方法 9

3.2分析方法 9

3.2.2色谱分析方法 9

3.2.2代谢物不同淬灭方法分析条件 10

3.2.3衍生化方法 10

第四章 实验结果与讨论 12

4.1 G. lozoyensis发酵液培养基碳源种类优化 12

4.2发酵培养基氮源浓度的优化 13

4.3不同淬灭与提取方法对代谢物提取的图谱结果 14

第五章 结论与展望 16

5.1 结论 16

5.2 展望 16

参考文献 17

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 纽莫康定B₀简介

1.1.1 棘白菌素类抗生素

棘白菌素,属于乙酰六环类，是一类新型抗真菌药，能够非竞争性的抑制真菌细胞壁中的 β(1,3)-D-葡聚糖的合成而杀灭真菌^[1]。因为葡聚糖是组成真菌细胞壁的重要成分，它能使细胞壁保持完整性并使其渗透压保持稳定。而哺乳动物细胞无细胞壁，故此对细菌无效。而且这类药物能够有效的杀灭对氮唑类和两性霉素B这两种抗生素产生抗性的真菌。且针对其对人体有较少的药物影响和毒性较低，也使得这类药物比传统的抗真菌药物拥有更广阔的医药市场。现已发现多种棘白菌素类药物，按结构特征大致可分为三类：echinocandin 类、pneumocandin 类和含硫脂肽类。同时从1988年开始试验，目前进入临床研究的有三种:米卡芬净、卡波芬净、安多芬净。

1.1.2 纽莫康定B₀——抗真菌药物卡泊芬净的前体

Merck公司科学家首度发现纽莫康定( Pneumocandin ) 类棘白菌素化合物并对其进行命名，其生产菌为Glarea lozoyensis^[2]，是从西班牙马德里的洛索亚流域附近的水塘中分离出来的一株丝状真菌^[3]，产的纽莫康定是一类由六肽和脂肪酸构成的酯肽^[4,5]，主要有A₀ 和B₀ 两种有效产物。通过对药效相对较好的产物B₀进行修饰，得到一种水溶性半合成衍生物卡泊芬净( Caspofungin )，商品名为赛克斯( Cancidas )，于2001年上市，是FDA批准的第一个上市的棘球白素类药物。卡泊芬净对耐氟康唑的孢子菌、念珠菌、曲霉菌均有很强的活性。如今，该产品已成为市场上全身用抗真菌的王牌药物。

图1 纽莫康定B₀ 和科赛斯的结构

1.2微生物代谢组学的研究方法与进展

1.2.1 代谢组学的介绍

代谢组学是考察生物体系受到刺激或扰动（比如环境变化或基因变异），和随时间的变化，其代谢产物的变化，对其进行全面、定量和定性的分析^[6]。在生化活动中，当基因和蛋白质的表达有微小改变，代谢产物会因此改变。而且科学家逐渐认识到：没有表达能力的基因组的变异，和没有生物活性的蛋白质浓度的改变，二者对系统都不会产生实质影响。同时，由于基因或蛋白质的功能补偿作用，某个的缺失会由于其他的基因或蛋白质的存在而得到补偿，最后影响为零^[8]。而代谢物处于生物系统的生化活动的最终结果，能够直接而全面的反映生理表型。因此代谢物是机体表型最好的指示剂^[7]。

1.2.2 微生物代谢组学的研究技术方法

图2 微生物代谢组学研究流程

1.2.3 微生物的培养

培养基为微生物的生长和代谢产物的形成提供了必须的营养物质和能量，是微生物发酵的重要影响因素之一。代谢组学因为是分析胞内产物，复杂的培养基成分会给胞内产物的分析带来干扰，虽然通过清洗细胞可以去除部分培养基成分，但是残余的成分仍然会给分析带来误差，所以代谢组学一般需要成分明确的培养基。因此需要对培养基进行优化，以获得纽莫康定B₀高产发酵的培养基。

请支付后下载全文，论文总字数：17680字