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摘 要

磷脂广泛用于食品、医药等领域，但是，很多情况下天然磷脂难于满足性能方面的要求。磷脂酶D（PLD）是一类特殊的酯键水解酶，它对细胞的结构和稳定性有很重要的作用 ,而且调控许多重要的细胞生理功能。因此对该酶的研究有重要意义。

大肠杆菌是目前应用最广泛的最成熟的基因工程表达系统，本研究通过构建磷脂酶D在大肠杆菌中的过表达系统，实现磷脂酶D在宿主菌BL21（DE3）中的大量表达，比较构建菌株与野生型菌株的磷脂酶D的表达量，尽可能高的实现磷脂酶D的产量。本研究中所用的诱导型表达质粒为pET28a（ ）,表达宿主为大肠杆菌Rosetta。首先通过PCR的方法获取了Rosetta中的PLD基因序列，通过分子生物学手段把它连接到诱导型表达质粒pET28a（ ）上，然后把该构建的pET28a（ ）-PLD质粒导入Rosetta中，进行诱导表达，诱导温度为30℃，最后通过SDS-PAGE蛋白电泳验证目的蛋白的表达效果，检测可溶性蛋白的表达量，目的蛋白是否形成包涵体。结果证明，PLD实现了在大肠杆菌中的同源表达，并且以可溶性蛋白的形式存在，包涵体较少。镍柱纯化后可获得高纯度磷脂酶D蛋白，磷脂酶D的产量达到30mg/L。

关键词：磷脂酶D 大肠杆菌 同源表达 诱导型质粒

Phospholipase D induced expression in E. coli

Abstract

Phospholipid is widely used in food, pharmaceutical industries and other fields, under most circumstances, natural phospholipids can not meet the requirements of the performance. Phospholipase D (PLD) is a special type of ester bond hydrolase, and the structure and stability of its cells have a very important role in the regulation of many important cellular and physiological functions. Therefore, the study of enzymes is important.

The present study was to construct phospholipase D overexpression system in E. coli, to achieve expression of a large number of phospholipase D in host bacteria BL21 (DE3) in compared with the wild type strain Construction of a strain expressing the amount of phospholipase D, as high as possible implementation of phospholipase D into production. Expression plasmid used was pET-28a, the expression host E. coli BL21 (DE3). Verify the effect of the target protein expression by SDS-PAGE protein electrophoresis, detection of the expression of soluble protein, if the protein formed inclusion bodies.

Key Words: Phospholipase D; Plasmid; Target protein; Enzymatic Properties

目 录

摘 要 I

第一章 文献综述 1

1.1 磷脂酶D的研究背景 1

1.2 磷脂酶D的催化机理 1

1.2.1 水解作用 2

1.2.2 碱基交换反应 2

1.3 影响磷脂酶D的因素 2

1.3.1 温度 2

1.3.2 PH 2

1.3.3 溶剂 3

1.3.4 盐类 3

1.3.5 基质的聚集状态 3

1.3.6 水分活度 3

1.4 磷脂酶D的应用 3

1.5 磷脂酶D的表达研究现状 4

1.5.1 PLD在大肠杆菌系统中的表达 4

1.5.2 PLD在枯草芽孢杆菌中的表达 4

1.5.3 PLD在链霉菌中的表达 5

1.6研究目的及内容 5

第二章 重组大肠杆菌菌株的构建 7

2.1 前言 7

2.2 实验材料和仪器 7

2.2.1菌株与质粒 7

2.2.2工具酶和试剂盒 7

2.2.3实验仪器 8

2.2.4实验试剂 8

2.2.5培养基 9

2.3 实验方法 9

2.3.1 PCR扩增PLD基因目的片段 9

2.3.2 大肠杆菌表达质粒的重组构建 11

2.3.3 大肠杆菌感受态的制备及重组质粒的转化 12

2.3.4重组大肠杆菌pET28a-pyrG-Rosetta及突变株诱导表达条件 13

2.3.5 重组蛋白的纯化的及鉴定 14

2.3.6考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 15

2.4 实验结果与讨论 16

2.4.1 PLD目的基因的PCR扩增 16

2.4.2重组质粒pET28a-PLD的构建 16

2.4.3 SDS-PAGE表达鉴定 18

2.5 本章小结 19

第三章 结论与展望 20

3.1 结论 20

3.2 展望 20

3.2.1PLD的分泌表达 20

3.2.2重组大肠杆菌的高密度发酵 20

参考文献 22

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 磷脂酶D的研究背景

广泛存在于自然界的磷脂酶D (PLD,EC3.1.4.4),在生物过程和生理功能,包括细胞信号传递中扮演了重要角色。磷脂酶D是磷脂酶超级家族中的一员,最早在植物中发现,对特殊磷脂表现了磷酸二酯酶活性,这类酶包括心磷脂合成酶,磷脂合成酶,痘病毒包膜蛋白,耶尔森氏小鼠毒素,和几种核酸内切酶。磷脂酶D (PLD)作为磷酸二酯酶超家族中的一员,是催化磷脂水解第一步反应的关键酶之一,它是一类重要的跨膜信号转导酶类,属于胞外酶,分别由一个基因家族的不同成员编码,广泛存在于微生物,植物和动物中磷脂作为生物体必不可少的物质受到越来越多的关注,虽然研究开展几十年来，取得了显著的成效，但是在酶产量，工业应用上还是有一定的困难，主要原因是酶源含量极微，提纯困难，酶的稳定性差只能在异相系统中作用以及酶在生物体内的作用机理还尚未清楚明白。随着细胞工程，基因工程等生物高技术的不断发展，我们有理由相信磷脂酶D的催化水解功能会得到更广泛的应用，也会有更所更好的磷脂酶D被发现。总之目前来看,磷脂酶D的发展空间很大，对我们其他产业的发展也有很大的帮助。现在我国生产的酶品种少, 活力较差, 且能高效生产酶的菌株类型也有限，因此急待加强微生物育种，高产菌株的选育和培养，以及对酶本身结构与功能的研究

PLD基因是一个多基因家族，根据它们的基因排列特点及相应功能域目前可分为5类：PLDα、PLDβ、PLDγ、PLDδ和PLDε。动物细胞中目前克隆到PLD1和PLD2两种基因。酵母中发现了两个PLD基因但只有一个得到鉴定。磷脂酶D有一个标志序列HKD，它分别为His（组氨酸）、Lys（赖氨酸）和Asp（天冬氨酸），HKD是PLD催化水解的活性部位。多数磷脂酶D还拥有可糖基化可磷酸基化区域。

1.2 磷脂酶D的催化机理

最早在植物中发现的磷脂酶D (PLD,EC3.1.4.4)作为磷脂酶超级家族中的一员,对特定磷脂表现出磷酸二酯酶活性, —般催化两个反应:催化磷脂酰胆碱(PC)水解生成磷脂酸(PA)和胆碱,此外,还催化磷脂酰基团发生转磷脂反应生成各种磷脂酰醇。

1.2.1 水解作用

磷脂酶D是一类特殊的酯键水解酶，它能催化水解磷脂分子中的磷酸和有机（如胆碱、乙醇胺等）羟基成酯的键，即4倍酯键，水解产物为磷脂酸和有机碱。

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