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摘 要

枯草芽孢杆菌作为微生物采油技术常用的一种微生物，它代谢的脂肽生物表面活性剂具有优良的乳化和降低油水界面张力的能力，并且可以适应油藏中的复杂环境，可提高油藏的采收率，在微生物采油中具有较好的应用前景。但是，菌体的的菌浓和活性对采油率起着关键性的作用。本课题经过单因素实验，测定发酵液中的活菌浓度、菌种生长量和pH，通过改变培养基中的氮源，来确定枯草芽孢杆菌生长的最佳氮源和最优培养基，从而提高枯草芽孢杆菌的活菌浓度，提高采油率。该实验结果表明：适合该种菌株的液体发酵培养基的最适氮源为蛋白胨，蛋白胨的最佳加入浓度为10g/L。优化后的最适培养基为：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L。最佳起始pH为7.0。最优条件下菌浓可达到10⁸CFU/mL。

关键词 枯草芽孢杆菌 发酵优化 氮源

High density nitrogen Optimization of Fermentation for Bacillus subtilis

Abstract

The Bacillus subtilis was commonly used in microbial enhanced oil recovery techniques. The biosurfactants produced by it have an excellent ability of emulsifying and reducing the interfacial tension at oil/water interfaces, and it can adapt to the reservoir complex environment. It could also can effectively improve oil recovery and has a good prospect in microbial enhanced oil recovery. Meanwhile, concentration and activity of bacteria play a key role in the process. This paper is based on single factor experiments. By measuring OD value of fermentation broth, biomass, pH value, and changing the nitrogen source of medium, to determine the optimum nitrogen source and optimal fermentation medium components of Bacillus subtilis. And then increase the concentration of viable bacteria Bacillus subtilis, to improving oil recovery rates.The experimental results showed that the optimal nitrogen source of Bacillus subtilis was peptone and its best concentration was 10g /L. The optimal fermentation medium components was peptone 10g / L, NaCl 5g / L, beef extract 5g / L. The optimal initial pH was 7.0. Under optimal conditions for bacteria concentrations reach 10⁸CFU/mL.

Key words Bacillus subtilis；fermentation optimization；nitrogen source

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 研究背景 1

1.2 研究的现状及分析 1

1.2.1 枯草芽孢杆菌 1

1.2.2 影响高密度培养的因素 2

1.2.3高密度培养的途径 3

1.透析培养 3

1.3 研究目的及意义 4

第二章 实验 5

2.1 实验材料 5

2.2实验方法 5

2.2.1培养方法 5

2.2.2检测方法 6

2.2.3枯草芽孢杆菌培养特征的研究以及基础生长曲线的绘制 6

2.2.4 起始pH的优化 6

2.2.5氮源的优化 7

2.2.6氮源的梯度优化 7

第三章 结果与讨论 8

3.1枯草芽孢杆菌的培养特征 8

3.2 基础培养基中枯草芽孢杆菌的发酵参数 8

3.3起始pH对枯草芽孢杆菌高密度发酵的影响 9

3.4 氮源种类对枯草芽孢杆菌高密度发酵的影响 10

3.5 氮源浓度对枯草芽孢杆菌高密度发酵的影响 13

第四章 结论与展望 17

4.1结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致 谢 21

文献综述

1.1研究背景

随着社会经济的发展，能源问题日益引起人们的关注和重视。据专家预计，在未来的50年，石油、天然气、煤炭等不可再生能源仍然是世界经济发展的主要能源。事实上，目前油田经过一次、二次石油开采，仍然有大约60%的石油残留在地下而无法被有效利用^[1]。而近些年来兴起的微生物采油技术相对于传统的采油方式经济、环保，可以解决许多现实应用中遇到的问题，提高了采油率^[2]（室内研究表明，微生物采油可在原有基础上提高采收率5%～12%^[3])。

微生物采油就是指将地面上分离培养的微生物菌液和营养液注入油层之中，或是单纯的注入营养液激活油层内微生物，使其在油层内进行生长繁殖，产生有利于提高采收率的代谢产物，从而提高油田采收率的采油方法^[3]。从微生物采油技术所用的微生物来看，包扩激活油层内源微生物和注入外源微生物。内源微生物采油技术与外源微生物采油技术相比，它并不需要向地层中注入微生物，只要通过添加激活剂，并且注入一定量的空气直接激活地层中的微生物，在开采现场并不需要添加大型的地面设备，操作简单，经济环保，因而具有更为广阔的应用前景^[4]。本实验中的枯草芽孢杆菌就是一种内源微生物，它代谢的脂肽生物表面活性剂具有优良的乳化和降低油水界面张力的能力^[5]，并且可以适应油藏中复杂的环境，提高油田采收率，在微生物采油技术中具有较好的应用前景^[6]。

所以说对枯草芽孢杆菌发酵进行优化是很有必要的，而高密度发酵培养是降低枯草芽孢杆菌发酵菌剂成本的重要方法之一。

1.2研究的现状及分析

1.2.1枯草芽孢杆菌

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的代表种。细胞呈直杆状，很少成链，染色均匀。借助周生鞭毛运动。属于革兰氏阳性菌。芽孢呈椭圆或圆筒状，壁厚，位于细胞的中央或近中央。琼脂培养基上的菌落呈圆形或不规则形状，不透明，有皱褶，可变为奶油色或棕色。当琼脂表面湿润时，菌落易于扩散，在琼脂表面生长的菌苔在液体中不易扩散。在液体培养时表面会形成暗色、皱褶和完整的菌膜，菌液轻度混浊或不混浊。在基础培养基生长时不需要维生素，可以以葡萄糖和铵盐作为其唯一的碳源和氮源。主要营有氧呼吸，在含有葡萄糖的复杂培养基中可以进行无氧呼吸，但其生长和发酵都很弱，主要产物为2，3-丁二醇、乙酰甲基甲醇和CO₂。

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