论文总字数：12879字

摘 要

NADH氧化还原辅酶在合成代谢,分解代谢以及能量生产过程中都发挥着重要的作用。维持细胞内辅酶的平衡对于细胞生长,代谢以及产物的产生都非常关键。尽管代谢工程的研究工作己经广泛开展,但代谢工程改造依然常常不能得到预期的效果,这与人们对细胞内的代谢过程,调控过程还不够了解有着很大的关系。辅酶在细胞中涉及的反应广泛,细胞内辅酶浓度的改变,也会引起代谢的广泛改变,同时影响产物的形成,这对于深入研究细胞的氧化还原,糖代谢和能量代谢都有很重要的作用,同时也为我们对细胞工厂的理性代谢工程改造提供理论基础。

关键词：NADH氧化酶；酿酒酵母；过表达；代谢调控；

Overexpression of NADH oxidase metabolic regulation of Saccharomyces cerevisiae

Abstract

NADH redox coenzyme plays an important role in the synthesis of metabolism, metabolism and energy production.. Maintenance of the balance of coenzyme in the cell is critical for cell growth, metabolism and production.. Although the metabolic engineering research work has the extensive, but metabolic engineering still often can't get the expected effect, which with people on intracellular metabolic processes, regulation is not enough to understand has a great relationship. Broad coenzyme is involved in the cell response, changes in intracellular coenzyme concentration will cause metabolic change widely. At the same time, the influence on the product formation, this for further study on the cell oxidation reduction, glucose metabolism and energy metabolism have very important role, and provides theoretical basis for our rational metabolic engineering transformation of plant cells.

Keywords: NADH oxidase; Saccharomycescerevisiae;overexpression;MetabolicRegulation;

目 录

摘 要 I

Abstract II

目 录 1

第一章 文献综述 2

1.1前言 2

1.2NADH 2

1.2.1 NADH氧化酶 2

1.2.2 NADH氧化酶的用途 2

1.2.3 过度水形成NADH氧化酶 3

1.2.4代谢工程 3

1.3本课题研究的目的与意义 3

第二章 材料与方法 4

2.1材料与方法 4

培养基 4

2.2 辅因子的测定 4

2.3培养方法 5

2.4实验试剂 5

2.5 实验仪器 6

第三章 实验结果与讨论 7

3.1结果 7

3.1.1辅因子测定数据 7

3.2讨论 7

第四章 失败原因分析 8

4.1 结论 8

4.2 展望 8

参考文献 9

致谢 10

第一章 文献综述

1.1前言

地球上的石油储量仅能支撑儿十年的大规模开采，替代资源开发对交通运输及相关产业的持续发展有巨大影响。燃料乙醉是可再生的循环资源，并且可以说用于生产乙烯等产品，有望支撑“后石油时代'.的石化工业。目前工业化生产的燃料乙醇绝大多数是以粮食作物为原料，在2007年度，全球总产量5%左右的粮食被用作生物能源生产，直接破坏了全球粮食供求均衡关系。因此，人们普遍认为以木质纤维素为原料的第二代生物燃料乙醇生产技术的突破是决定其未来能否大规模替代石油的关键。

近年来，基于辅酶因子的代谢工程在酿酒酵母的代谢研究中发展迅速。酿洒酵母中water-forming NADH氧化酶的引入，可以减少细胞质中NADH的积累。从而减少甘油的形成(Heuxeral.2006:Vemurietal.2007)。而酿酒酵母中Histopasma capsulatum来源的alternative氧化酶的引入，则可以减少线粒体的NADH的形成，从而提高了线粒体氧化丙酮酸的能力，,提高了葡萄糖的代谢，进而减少了乙醇的积累(Vemuri et al.2007)。因此线粒体和细胞质中的辅酶代谢独立的过程，他们对产物的影响也是不同的。

1.2NADH

1.2.1 NADH氧化酶

NADH氧化酶是一类催化NADH氧化为NAD 并消耗氧气的氧化还原酶，因其能够再生NAD 而成为人工调控微生物代谢流向的重要调控酶。文中综述了NADH氧化酶的分类、理化性质、反应机制，并分析NADH氧化酶清除细胞内氧毒性、介入细胞代谢过程，以及调节细胞生理和代谢等重要的生理功能.(1) NOX广泛存在于乳酸菌中，诸如乳酸杆菌属（Lactobacillus）、小球菌属（Pediococcus） 、菌属(Leuconostoc}、球菌属( Streptococcus)和肠球菌属( Enterococcus)等22种乳酸菌株中都有N性.Sakamotc)等（2）大多数乳酸菌株在有氧条件下具有NOX酶活，并且同时含有NOX-1和NOX-2的菌株在有氧条件下生长良好，而只含有其中一种的菌株在有氧条件下生长缓慢。NOX大部分分布在细胞质中，在细胞膜上也检测出少部分NOX酶活.在某些嗜热菌中也发现有NOX如Coccc)等(3)在嗜热水生菌(Thermusayuata)中发现N0X-1，且这种酶能耐95℃的高温。Park等(4)发现嗜热栖热菌(Thermus thermophalus HB8)中存在NOX-1活性.Masull)等(5)。

1.2.2 NADH氧化酶的用途

传统使用面包酵母，酿酒酵母，乙醇生产的已造成的累积有关重大信息的遗传，代谢，工艺开发。因此，在收集正在使用的酿酒酵母生产英镑扩大到包括有机酸和甚至次级代谢产物。平衡降低程度的分解代谢货币在基板和产品之间，通常的NADH。在S.酵母，NADH被主要甘油醛-3-磷酸脱氢酶等同化产生于胞质溶胶反应的酶（9）。葡萄酒是葡萄衍生的酒精饮料果汁（也称为葡萄汁），极受欢迎遍布世界各地。随着更多的历史比8000年，葡萄酒产量是世界上的一个最古老的生物技术工艺。从看理化点，酒可以被定义作为非理想，多组分液体溶液含有水，乙醇，甘油和有机酸作为主要成分，以及其它少量组件，如调味剂，芳香剂和酚醛化合物。这些要么最初存在于葡萄酿酒或在合成。酿酒酵母也是应用最广泛1使用的模型真核系统。超过10年因为它的基因组的测序已通过。此后，许多功能分析项目F.皮萨罗，F. A.巴尔加斯和E. Agosin一直致力于调查其分子生物学。它最初被认为，获得基因组序列后，一会获得了全面的信息微生物的内部运作。然而，该从基因组测序所带来的复杂性项目所需的新的全面的后基因组策略。这些包括先进的研究调节机制，以及应用新的高通量技术在和灰不同级别的复杂性的细胞（基因组，转录组，蛋白质组和代谢组），并所得到的数据的有效分析该需要的应用程序的新的生物信息学方法在综合或系统生物学的角度（10）。

1.2.3 过度水形成NADH氧化酶

大量的研究在过去的20年中已经完成D-木糖的酵母转化为乙醇，与主要努力集中对细菌和真菌木糖的功能性表达利用基因和操纵戊糖磷酸途径（PPP），以提高D-木糖利用发酵中S.酵母（11,12,13,14）。

1.2.4代谢工程

代谢工程的策略，因为微生物代谢经常受到严格的监管并且由质量，能量和氧化还原约束在大量的细胞内的守恒定律代谢产物。此外，由于代谢途径和相关的监管过程中形成复杂的分子和功能相互作用网络，只有通过代谢分析一个综合的系统方法，一个可评估的特定的遗传修饰的效果。在这里，代谢模型预测基于生物化学信息细胞生理学化有很大的帮助，尤其是当它们是建立在基因组水平。根据在酵母基因组规模模型，帕蒂尔和同事已经开发出一种生物信息学工具名为OptGene使用进化规划算法来识别套基因缺失，最大限度地提高产量- 或者生产力（产量和增长速度）- 一个给定的代谢产物。这种方法建议的策略是不跨越几个直观的遗传修饰不同的途径。

代谢工程方法介绍在图1中主要是针对遗传操控的生物。尽管科学通过成就应变发展基因技术，商业开发的应变对于葡萄酒行业不能涉及，此时的基因工程技术（见综述[102]）。然而，如果不同的方法进行改性酵母的菌株的使用，诸如定向进化，突变/选择，杂交或任何上面提到的方法中，可用的工具对于全基因组分析可以被用来确定所获取的特征是否符合所期望的物候类型和可用于突变体的筛选携带天然缺失在感兴趣的基因。获得修改后的毒株后，仔细分析应在新菌株进行，涉及的系统方法，使用转录，代谢和/或流量分析（最好是在组合）来评估生理在执行遗传修饰的影响。此系统允许可能的副作用更好的评价从基因改造所产生的影响（如形成的异味）。这些数据也是在进一步modifica-设计阶段很有价值行动（迭代过程）工业菌株的遗传改良传统上依赖于传统的遗传技术- 如变量选择，诱变，杂交（交配，孢子细胞交配），罕见交配，cytoduction和原生质体融合- 其次是选择了广泛的特性，如fer-心理状态的能力，酒精耐受和缺乏异味（例如硫化氢）。这些方法是特别有利的，以改善并结合下的多基因控制的性状和不引起所包含的产品转基因生物的定义（转基因）。因此，应变与这些改善方法不具有相同水平的治疗公共怀疑为是已葡萄酒酵母转化的外源DNA，并且不受到，涉及到转基因生物一样严格的规定(16)。尽管相当多的工作，一个主要的限制这些技术是他们的难度增加或代谢工程方法介绍在图1中主要是针对遗传操控的生物。尽管科学通过成就应变发展基因技术，商业开发的应变对于葡萄酒行业不能涉及，此时的基因工程技术见综述[17]。然而，如果不同的方法进行改性酵母的菌株的使用，诸如定向进化，突变/选择，杂交或任何上面提到的方法中，可用的工具对于全基因组分析可以被用来确定所获取的特征是否符合所期望的物候类型和可用于突变体的筛选携带天然缺失在感兴趣的基因。获得修改后的毒株后，仔细分析应在新菌株进行，涉及的系统方法，使用转录，代谢和/或流量分析（最好是在组合）来评估生理在执行遗传修饰的影响。此系统允许可能的副作用更好的评价从基因改造所产生的影响（如形成的异味）。这些数据也是在进一步modifica-设计阶段很有价值行动去除应变功能而不改变其性能(17)。

1.3本课题研究的目的与意义

该工作的目的是为了研究在酿酒酵母中减少线粒体或者细胞质中的NADH的浓度对代谢的影响，并研究NADH的减少偶连或者不偶连NADPH的产生以及ATP的消耗的差别。因此，我们在酿酒酵母中表达了(l) S .pneumonia(Auzat et al.1999)的NADH氧化酶(由nox 基因编码)。它在氧气的参与下。催化细胞质中的NADH转变成NAD ；(2) H.capsulatum (johnsonetal.2003)来源的alternative氧化酶(由AOX1基因编码)。它钓泛索的参与下。氧化线粒体中的NADH；(3)酿酒酵母本身的线粒体NADH激酶(由POS5基因编码)：(4)在酿酒酵母细胞质中表达NADH激酶(去除线粒体导肤序列的POS5基因)；(5)在酿酒酵母中表达来源于E. coli (Boonstra et al. 1999)的可溶性转氢酶(由 udhA 基因编码)，井比较基因表达对酵母代谢的影响。

第二章 材料与方法

2.1材料与方法

培养基

NaOH调PH值至5.2~5.4

2.2 辅因子的测定

2.1.1 NADH和NAD 的测定

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