精氨酸脱亚胺酶催化制备D-精氨酸工艺研究毕业论文
2022-05-11 20:31:52
论文总字数：18274字
摘 要
D-精氨酸( D-Arg) 是一种非蛋白质组成的氨基酸，是合成抗艾滋病药、心脑血管药、抗瘤药和减肥药等的重要中间体。精氨酸脱亚胺酶是一种具有重要应用前景的抗肿瘤酶类酶。精氨酸脱亚胺酶广泛分布于细菌、古细菌和少数低等真核生物中[5]。目前研究证实，精氨酸脱亚胺酶不但能抑制多种恶性肿瘤细胞的体外增殖，还能够抑制体内的恶性肿瘤增生，作为一种新型抗肿瘤物质已经受到越来越多研究者的重视[8]。
本实验利用基因工程技术从粪肠球菌（Enterococcus faecali）中扩增出精氨酸脱亚胺酶（ADI）基因片段，将PCR片段连接至表达载体并转化至感受态细胞中获得能够表达精氨酸脱亚胺酶的工程菌。再利用工程菌中的精氨酸脱亚胺酶对DL-精氨酸进行酶法转化，通过发酵条件优化和反应条件优化获得高收率的D-精氨酸。
关键词：D-精氨酸 精氨酸脱亚胺酶 应用 制备
Study on Preparation of D- arginine by arginine catalyzed by arginine
Abstract
D- arginine (D-Arg) is a kind of non protein amino acid， which is an important intermediate in the synthesis of anti AIDS drugs， cardiovascular and cerebrovascular drugs， anti tumor drugs， and weight-loss drugs， etc.. Arginine deiminase (ADI) is a kind of important potential antitumor enzymes. The arginine - free and enzyme - distributes bacteria， ancient bacteria， and a few lower eukaryotes[5]. At present， the study confirmed that arginine deiminase can not only inhibit the proliferation of a variety of malignant tumor cells in vitro， but also can inhibit the in vivo of malignant tumor growth， as a new antitumor substances has got more and more research attention [8].
In this study， the adi gene that encodes ADI was cloned by PCR amplification from Enterococcus faecalis. The adi gene was connected into expression vector pET-28a and its product ADI was over-expressed in Escherichia coli BL21(DE3). The DL-Arg was transformed by the enzymatic method of the arginine deiminase from the engineering bacteria， and the high yield D-Arg was obtained by optimizing the fermentation conditions and optimizing the reaction conditions.
Key words：D- arginine; arginine deiminase; application; preparation
目 录
摘 要 I
Abstract II
第一章 引言 1
1.1 精氨酸脱亚胺酶(ADI)的来源及性质 1
1.1.1 精氨酸脱亚胺酶(ADI)的来源及性质 1
1.2 精氨酸脱亚胺酶的用途 1
1.2.1 精氮酸脱亚胺酶具有成为抗癌药物潜力 1
1.2.2 精氨酸脱亚胺酶具有预防龋齿的作用 2
1.2.3 精氨酸脱亚胺酶可用于生产L-瓜氨酸 2
1.3 D-精氨酸的应用和生理作用 2
1.3.1 可减少肥胖 2
1.3.2 可调控肿瘤细胞的生长 2
1.3.3 在医学和动物繁殖中的应用 3
1.4 D-精氨酸的制备 3
1.4.1 化学方法 4
1.4.2 生物化学法 4
1.5 研究意义 5
第二章 重组菌株的构建 6
2.1材料与方法 6
2.1.1 主要试剂与仪器 6
2.1.2 方法 8
2.2结果与讨论 9
2.2.1 ADI基因的PCR扩增 9
2.2.3基因片段及表达载体的双切 11
2.2.4片段与载体的连接 11
2.3小结 12
第三章 精氨酸脱亚胺酶（ADI）的诱导表达 13
3.1材料与方法 13
3.1.1主要仪器与试剂【同2.1.1】 13
3.1.2方法 13
3.2结果与讨论 14
3.2.1碳源种类的优化 14
3.2.2 碳源浓度优化 15
3.2.3 氮源种类优化 15
3.2.4 氮源浓度的优化 16
3.3小结 17
第四章 酶法生产L-瓜氨酸和D-精氨酸的研究 18
4.1材料与方法 18
4.1.1主要试剂和仪器 18
4.1.2方法 18
4.2结果与讨论 20
4.2.1初始pH对反应的影响 20
4.2.2 温度对反应的影响 21
4.2.3 金属离子种类及浓度对反应的影响 21
4.2.4 底物浓度对反应的影响 22
4.3小结 23
第五章 结论与展望 24
5.1 结论 24
5.2 展望 24
参考文献 25
致谢 26
第一章 引言
1.1 精氨酸脱亚胺酶(ADI)的来源及性质
自从F.Horn于1933年首次报道绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中含有ADI[7]以后，相继有多个报道称于假单胞菌，支原体，盐杆菌，乳球菌，原生动物等中发现ADI，源于不同种微生物的ADI性质比较见表1[5]。
表1 不同来源微生物的ADI性质比较
来源 | 分子量/KDa | 酶活（U· | 最适pH | Km（mmol· | 氨基酸相似度/% |
Pseudomonas putida | 120 | 58.8 | 6 | 0.2 | 96.4 |
Pseudomonas aeruginosa | 90 | / | 5.6 | / | 84.7 |
Lactococcus lactis | 140 | 140.3 | 7.2 | 8.7 | 31.6 |
Mycoplasma arginini | 90 | 44.5 | 6.5 | 0.2 | 27.1 |
Enterococcus faecalis NJ402 | 190 | 8.15 | 6.5 | 3.27 | / |
Pseudomonas plecoglossicida(WT) | 49 | 4.76 | 6 | 2.88 | 100 |
Pseudomonas plecoglossicida M314 | 49 | 21.7 | 6.5 | 0.43 | 99.3 |
由表1可知，不同微生物来源的ADI性质也不同，6种不同ADI的分子量从49 KDa-190 KDa不等，比酶活范围从5.4-140.3 U/mg，最适pH范围从5.6-7.6，其中来自Mycoplasma arginini 和Pseudomonas plecoglossicida 的ADI氨基酸同源性只有27.1%。
1.2 精氨酸脱亚胺酶的用途
1.2.1 精氮酸脱亚胺酶具有成为抗癌药物潜力
氨基酸降解酶，如L-天冬酰胺酶因其降解天冬酸胺的作用而被用来治疗癌症[5]。精氨酸对于人类而言是一种半非必需氨基酸。正常细胞可经尿素循环由精氨酸-琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸-琥珀酸裂解酶(AL)催化瓜氨酸获得。如果肿瘤细胞生长需要精氨酸但不表达ASS，那么其生长就要依赖于外部环境提供精氨酸。已经证实，通过精氨酸降解酶—精氨酸脱亚胺酶(ADI)降解精氨酸可抑制精氨酸缺陷型肿瘤(如黑素瘤以及肝细胞瘤)的生长，而对正常细胞的生长无影响[9，10]。
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