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摘 要

丁二酸作为一种重要的化合物，有其重要的价值，已经被广泛认为是一个潜在的平台化合物并用于多种高附加值化学品的生产。目前，丁二酸的主要来源是通过石油化工领域通过化学方法合成。由于化工领域污染较大，潜在的问题较多，所以近来基于微生物的丁二酸生产越来越受到关注。其中，大肠杆菌是研究中使用最多，也是研究的最好的丁二酸生产菌株之一。因为它的基因工程策略是相对成熟的，相关研究者已作出相当多的努力用来改造大肠杆菌生产丁二酸。但是，基因工程菌本身存在一定的局限性，基因型不太稳定，在实际生产过程中，菌株极易发生退化现象，使得丁二酸产量下降。因此，需要对菌株进行复壮才能使其恢复较好的发酵产酸能力，达到工业化生产的要求。基于此，本实验采取循环式分离纯化法和抗性平板胁迫复壮对大肠杆菌AFP111进行复壮，并对筛选的菌株进行血清瓶厌氧发酵，通过测定厌氧条件下其产酸、糖耗和生长情况考察筛选菌株丁二酸的生产性能。最终筛选出了一株在一步厌氧条件下丁二酸产量达8.99 g/L的大肠杆菌A11，丁二酸的收率达到0.67 g/g葡萄糖，相比于原始菌株增加了71.89%，达到了复壮优化的目的。

关键词：AFP111 丁二酸 复壮 发酵

Rejuvenation research for succinic acid production by E. coli

Abstract

Succinic acid is one of the most important basic substances for many kinds of chemicals with high added value. With its important value, succinic acid has been widely recognized as a potential platform chemical for the production of many chemicals. At present, the main source of commercial production of succinic acid is the chemical synthesis of petroleum. Recently, microbial-based succinic acid production has attracted more and more attention. E. coli is one of the most used microorganisms in the study. Also, E. coli is one of the best studied microorganisms, because its genetic engineering strategy is relatively mature. Related researchers have made considerable efforts to transform E. coli to produce succinic acid. Because the strain degeneration phenomenon will happen in the actual production process, rejuvenation of strain is needed to make it restore good fermentation ability to produce succinic acid and meet the requirements of industrial production. This experiment adopts circulating separation and purification method and the resistant plate method to optimize strain, and 100 mL serum bottle anaerobic fermentation verification was conducted to determine the production of succinic acid, sugar consumption and growth under anaerobic conditions. Finally screened a strain under anaerobic conditions which the succinic acid yield was 8.99 g/L, succinic acid yield reached 0.67 g/g glucose, increased by 71.89% compared with the original strain, achieved the effect of rejuvenation and optimization.

Key Words: AFP111; succinic acid; rejuvenation; fermentation

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 丁二酸的理化性质及应用 1

1.2 丁二酸的合成方法 2

1.3 产丁二酸大肠杆菌的改造 3

1.4菌种复壮 5

1.5 本实验目的及内容 6

第二章 材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.2培养基及试剂配制 10

2.3 实验方法 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 原始菌株AFP111生长曲线 13

3.2 菌种生长鉴定 13

3.3 菌株发酵性能验证 17

第四章 总结与展望 20

致 谢 21

参考文献 22

第一章 前言

1.1 丁二酸的理化性质及应用

1.1.1 丁二酸的理化性质

琥珀酸，科学上采用的专业名称为丁二酸(succinic acid)，在生物圈中广泛存在^[1-5]。丁二酸的分子式：HOOCCH₂CH₂COOH。相对分子质量：118.09。丁二酸的分子式如下图 1-1所示。

图 1-1 丁二酸的化学结构式

丁二酸有二种晶体类型，其熔点为180~188℃，沸点为235℃（分解温度），是无臭且无色的晶体，能溶于水^[6-8]。

1.1.2 丁二酸的主要应用领域

丁二酸的传统产业运用包含生产聚丁二酸丁二醇酯，聚酯多元醇。在食品工业中用作酸化剂，香料和增甜剂，应用于制药业，以及生产的树脂，涂料和颜料。

在生物经济时代，丁二酸将演变成一个作为马来酸酐的替代品的中间体平台化合物，用于生产各种高附加值平台化学物质^[9]。

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