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摘 要

本文主要介绍使用竞争ELISA和双位点夹心ELISA两种方法对单克隆抗体抗原表位鉴定的方法。并对这两种ELISA方法对抗体抗原表位的特异性、准确度、精密度和灵敏度进行了评价。单克隆抗体生产的意义是主要是利用单克隆抗体进行一些疾病的诊断，目前主要表现在人类疾病和畜禽传染病的诊断方面，尤其在一些感染性疾病和肿瘤的诊断方面，主要通过鉴定病原体或肿瘤抗原来诊断人是否感染疾病因。而ELISA实验方法在单克隆中的筛选，定株便起到了非常重要的作用。

关键词： Elisa 抗原表位 单克隆抗体

ABSTRACT

This article mainly introduces the methods of using the competitive ELISA and the double locus sandwich ELISA to identify the epitope of monoclonal antibody in two ways. The specificity, accuracy, preision and sensitivity of these two ELSIA methods were evaluated. The significance of monoclonal antibody production is mainly the diagnosis of some diseases using monoclonal antibodies, at present mainly in the diagnosis of human diseases and infectious diseases of livestock, especially in the diagnosis of some infectious diseases and tumors, mainly through the identification of pathogen or tumor anti original diagnosis of human is infected with disease. ELISA experimental method in the monoclonal screening, the strain will play a very important role.

Keywords: ELISA; Epitope; Monoclonal Antibody

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 单克隆抗体生产流程 1

1.1.1免疫动物 1

1.1.2 细胞融合 2

1.1.4 杂交瘤细胞阳性克隆筛选与扩大培养克隆化 2

1.1.5 单克隆抗体的生产 3

1.2抗原表位 3

1.2.1抗原表位类型 4

1.3 ElISA实验 4

1.3.1 ELISA必须遵守以下三个核心原理： 4

1.3.2 常用于临床检测的ELISA主要有以下几种： 5

1.3.3 ELISA实验主要步骤： 5

第二章 竞争ELISA对单克隆抗体抗原表位的检测 8

2.1 实验材料与仪器 8

2.1.1实验材料 8

2.1.2 实验仪器设备 9

2.2实验过程 9

第三章 双位点夹心ELISA对单克隆抗体抗原表位的鉴定 14

3.1 实验材料与设备 14

3.2 实验方案 15

第四章 两种表位鉴定的比较 19

1.竞争法ELISA 19

2. 双位点夹心 ELISA法 20

5.参考文献 24

6致谢 26

第一章 文献综述

1.1 单克隆抗体生产流程

在动物脾脏中有几百万种不同种类的B淋巴细胞系统，DNA的选择性表达会表达出不同基因B淋巴细胞从而合成不同的抗体。在机体感受到抗原刺激的时时候，这个时候抗原蛋白分子上的许多抗原决定簇（即本文中的表位）就会分别激活各个不同基因表达的B细胞。这些被激活的B细胞增殖分裂形成相应效应B细胞（浆细胞）和相应记忆B细胞。这些大量效应B细胞大量在成熟之后就会合成和分泌大量的特异性抗体分子，一般分布到血液和体液中[1]。至此于此，这些针对不同抗原表位的抗体总的便是我们日常所说的多克隆抗体。单克隆抗体便是在多克隆抗体中选择出一种效应B细胞使其分泌一种专一的抗体的浆细胞进行培养，这就可得到由单一细胞经过增殖分裂而形成一个细胞群，这个细胞群分泌的具有单一属性的抗体即单克隆抗体^[2]。单克隆抗体在国际从1975年开始经过了快速的发展。其特别是在杂交瘤技术被发明出来后它极大的推动了单克隆抗体的发展。使单一的单克隆抗体可以大量被制备成为生物领域的一大进程。特别是关于鼠源的单克隆抗体^[3]。

1.1.1免疫动物

在现在单克隆单抗生产中我们免疫的动物主要有小鼠，大鼠，兔，鸡等动物。

此处我们以免疫小鼠为例。在单克隆抗体生产中免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。

一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定好的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

免疫方式主要有皮下注射(ih)，腹腔注射（ip），静脉注射（iv）[4]。

实验中的动物在取血时对待不同的检测动物，在提取动物血液的方法会存在差异。

实验兔；耳缘静脉（检测血），耳动脉（中途放血），颈动脉（安乐死）

实验小鼠: 眼眶取血（检测血）,摘眼球（安乐死）。

实验大鼠：尾静脉（检测血），心脏采血（安乐死）。

实验豚鼠：耳缘静脉（检测血），心脏采血（安乐死）。

1.1.2 细胞融合

末次免疫后3～4天，分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。常见的融合有PEG化学法融合，与电融合法。脾细胞和骨髓瘤细胞融合后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义,融合后的细胞用HAT培养基选择杂交瘤细胞[5]。

HAT培养基选择原理:

H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶

(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase)

次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT )

H 外源性途径（旁路途径）

谷氨酰胺

OR 二氢叶酸还原

单磷酸尿苷酸 DNA

内源性途径（主途径）

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