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摘 要

漆酶是一种多酚氧化酶，它含有铜元素，能够通过氧化还原反应,对多种酚类和芳胺类化合物进行氧化,而氧分子还原为水。漆酶蛋白中氨基酸结合了多个铜离子组成蛋白质，所以该酶属于铜蓝氧化酶，在自然界中漆酶存在菇、菌等微生物中及高等植物中。漆酶能够直接作用于木质素，也能够氧化降解含酚结构的木质素单元结构，在介体存在条件下，也可以对其他酚型的木质素结构单元起到氧化降解的作用发生反应后唯一的产物就是水，本质上是一种环保型酵素。因此漆酶应用于纸浆的生物漂白过程减少污水的产生、对工业废水处理便于工业水的循环利用、对有机染料脱色处理减少成本和高分子的催化合成提高化学反应效率等方面，表现出了很大的研究价值和应用潜力，漆酶因为它的环保特性,被认为是未来制浆造纸工业在中降低成本,保护环境最具有发展前景的酶.目前可作为漆酶反应的介体大都是非天然的,由人工合成,这些介体因此价格昂贵且具有很强的毒性，会对环境产生较重的污染.

本研究以枯草芽孢杆菌基因组中的漆酶基因cotA为研究对象,根据其DNA序列设计PCR引物，通过PCR扩增cotA基因片段，然后将cotA基因与载体通过限制酶酶切、DNA体外连接、转化等克隆到大肠杆菌表达载体；运用菌落PCR、DNA测序及酶活性测定等对含有候选克隆进行分析,获得分泌表达漆酶CotA的大肠杆菌菌株。

关键词：漆酶 cotA基因 表达载体 枯草芽孢杆菌

Construction of expression vector for CotA laccase from bacillus subtilis

ABSTRACT

Laccase is a polyphenol oxidase copper element, it can use oxygen on a variety of phenolic and aromatic amine oxide, returning the molecular oxygen to water.Laccase is a combination of multiple copper ions in protein, belongs to ceruloplasmin oxidase, the presence of mushrooms, bacteria and plants;it able to act directly on lignin, a structural unit of lignin oxidative degradation of phenol in the presence of mediators conditions and the only product is water.It is an environmentally friendly nature of the enzyme. The phenol may be other lignin structural units play a role in oxidative degradation reactions.Therefore, biological enzyme used in the pulp bleaching process paint to reduce the generation of waste water, industrial waste water treatment industry to facilitate water recycling, organic decolorization processing costs and reducing catalytic polymer synthesis to improve the efficiency of chemical reactions, etc.Showing a very great research value and potential applications of laccase because of its environmental characteristics, are considered the future in pulp and paper industry to reduce costs, protect the environment, the enzyme most promising.Paint is currently available as an enzymatic reaction mediator mostly unnatural, by the synthetic. These mediators therefore expensive and highly toxic, an environmental heavier pollution.

This study, cotA-laccase gene from Bacillus subtilis, according to its DNA sequence design PCR primers, cotA gene fragments by PCR amplification, and cotA gene by restriction enzyme, connectivity, transformation of cloned into Escherichia coli expression vectors; using colony PCR, sequencing and enzyme activity assays, analysis of candidate clones, for secretory expression of laccase CotA strains of Escherichia coli.

Key words: laccase； cotA； expression vector；bacillus subtilis

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2 漆酶的结构 1

1.3 漆酶的催化氧化 3

1.3.1 漆酶活性的影响因素 3

1.3.2 漆酶的催化氧化过程 3

1.4本课题的主要研究内容 4

第二章 材料与方法 6

2.1材料与仪器 6

2.1.1 实验材料 6

2.1.2 主要试剂 6

2.1.3主要仪器 6

2.2实验方法 7

2.2.1 大肠杆菌的培养、质粒转化及质粒提取 7

2.2.2 pXMJ19质粒酶切产物与DNA Oligo的退火产物的连接 11

第三章 结果与讨论 14

3.1 枯草杆菌cotA基因的T-克隆 14

3.2枯草杆菌cotA基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-22b 15

3.3 pET-22b-COTA转化大肠杆菌BL21及COTA的表达 16

第四章 总结与展望 18

4.1总结 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1引言

漆酶是一种多酚氧化酶，它含有铜元素能够通过氧化还原反应,借助氧对多种酚类和芳胺类化合物进行氧化,将氧分子还原为水^[1]。漆酶蛋白中氨基酸结合了多个铜离子组成蛋白质^[2]，所以该酶属于铜蓝氧化酶，在自然界中漆酶存在菇、菌等微生物中及高等植物中。在介体存在条件下，也可以对其他酚型的木质素空间结构单元起到氧化降解的作用发，生反应后唯一的产物就是水，本质上是一种环保型酵素。因此漆酶应用于纸浆的生物漂白过程减少污水的产生、对工业废水处理便于工业水的循环利用、对有机染料脱色处理减少成本和高分子的催化合成提高化学反应效率等方面，表现出了很大的研究价值和应用潜力，漆酶因为它的环保特性,被认为是未来制浆造纸工业在中降低成本,保护环境最具有发展前景的酶^[3]。目前可作为漆酶反应的介体大都是非天然的,由人工合成,这些介体因此价格昂贵且具有很强的毒性，会对环境产生较重的污染.

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