论文总字数：26789字

摘 要

光学活性的芳基醇是合成药物和其他精细化工品的重要中间体。利用生物催化剂微生物细胞和酶来高效合成手性醇。由于生物催化剂具有绿色、高效、选择性高、反应条件温和易于制备和操作使用等特点，更加优于化学法，成为近年来研究的热点。本课题组发现解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109）具有不对称还原前手性酮合成手性醇的能力，基于基因组探矿技术，获得了两个潜在的羰基还原酶YlCR1（Cl-2）和YlCR2（FabG）。

本论文通过重组表达羰基还原酶YlCR1（Cl-2）和YlCR2（FabG），并纯化获得了YlCR1和YlCR2纯酶，通过蛋白电泳表明纯化后的YICR1和YlCR2大小分别为30KDa,35KDa。紧接着考察了两个羰基还原酶对于底物2,2,2-三氟甲基苯乙酮、3,5-双三氟甲基苯乙酮、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（OPBE）的催化活性。

其中，以OPBE为主要研究底物，考察了温度、pH、离子和有机溶剂对Cl-2的影响。进而构建了两种不同的催化体系：以异丙醇为辅底物的底物偶联系统和以葡萄糖脱氢酶（GDH）的双酶耦联系统。为了进一步分析产率和转化率，进而摸索出了可靠的气相分析方法。研究结果表明：Cl-2的最适pH为8.0，最适温度为35℃；以50mM的OPBE为底物，反应18h,双酶系统的对映体纯度为78.1%S，双底物系统的对映体纯度为81.3%S。目前，关于研究S-HPBE的报道并不多，所以本文的研究工作有很深的研究意义。

关键词：解脂耶氏酵母 手性醇 羰基还原酶 不对称还原

ABSTRACT

Optically active chiral alcohols are important intermediates in pharmaceutical synthesis and other fine chemicals. Microbial cells and enzymes were used as biological catalyst to efficient synthesis of chiral alcohols. Since the biological catalysts are green, high efficiency, high selectivity and work at mild reaction conditions such as easy preparation, operation characteristics. In recent years, biological methods become a research hotspot. The former in our group found that Yarrowia lipolytica yeast (Yarrowia lipolytica ACA-DC 50109) has the ability to asymmetric reduction of oprochiral ketone to chiral alcohols. Putative NADPH-dependent carbonyl reductases were cloned by genome data mining.

In this paper, recombinant carbonyl reductase YlCR1 (Cl-2) and YlCR2 (FabG) were studied with several substrates. After purification, the molecular size of CR1 and CR2 were 30KDa and 35KDa. Later, the characterization of the two enzymes YICR1（Cl-2）and YICR2（FabG）towards 2,2,2-trifluoromethyl acetophenone, 3,5-Bis (trifluoromethyl) acetophenone, 2-oxo-4-phenylbutyrate (OPBE) were studied.

Tthe effects of temperature, pH, ionic and organic solvents on the activity of Cl-2 towards 2-oxo-4-phenylbutyrate were further researched. And then two different catalytic systems were constructed, substrate-coupled system (using isopropanol as cosubstrate) and enzyme-coupled system (using glucose dehydrogenase (GDH) as coenzyme). The reliable GC analysis methods of OPBE and R-HPBE were explored. The results showed that the highest activity of YlCR1 was obtained at 35 ℃ and pH 8.0. Using recombinant E.coli BL21/pET28a-YlCR1 whole cells, 50mM OPBE could be reduced to 78.1% S-HPBE and 81.3% S-HPBE after 18h in enzyme-coupled reaction system and substrate-coupled reaction system, respectively. Currently, researches on S-HPBE are rare, this work would give more expected result in the future.

Keywords: Yarrowia lipolytica; Chiral alcohols; Carbonyl reductase; Asymmetric reduction

目录

摘要 I

ABSTRACT II

目录 III

第一章 绪论 1

1.1 手性化合物 1

1.2 手性醇类化合物 1

1.3 手性醇的制备方法 1

1.4 生物法不对称合成手性醇的研究现状 3

1.5 本课题的研究目的及意义 6

1.6 本论文的主要研究内容 7

第二章 重组菌株的表达及酶学性质研究 8

2.1 引言 8

2.2 实验材料 8

2.2.1实验仪器 8

2.2.2实验试剂 9

2.2.3菌株 9

2.2.4培养基 9

2.3 实验方法 9

2.3.1从冻存菌种提质粒转化E.coli BL21 9

2.3.2重组大肠杆菌培养及产酶 10

2.3.3重组羰基还原酶YlCR1和YICR2的纯化 10

2.3.4表达产物的SDS-PAGE 分析 10

2.3.5酶活测定 10

2.3.6重组羰基还原酶YlCR1的酶学性质研究 11

2.4结果与分析 11

2.4.1从冻存菌种提质粒转化E.coli BL21 11

2.4.2重组大肠杆菌E.coli BL21/pET28a-YlCR培养及产酶培养。 12

2.4.3 羰基还原酶的纯化 12

2.4.4表达产物的SDS-PAGE 分析 13

2.4.5酶活测定 13

2.4.6 以OPBE为底物YICR1酶的最适pH和酶的最适温度 14

2.4.7 金属离子，EDTA和有机溶剂对酶活的影响 15

2.5本章小结 16

第三章YICR1催化OPBE不对称还原反应 18

3.1引言 18

3.2 实验材料 18

3.2.1实验仪器 18

3.2.1实验试剂 18

3.2.3菌株 19

3.2.4培养基 19

3.3 实验方法 19

3.3.1蛋白含量的测定 19

3.3.2组羰基还原酶YlCR1的酶活研究 20

3.3.3 OPBE及R-HPBE的气相分析方法的建立 20

3.3.5 辅酶NADPH浓度的测定 21

3.3.6重组羰基还原酶对OPBE的不对称还原 21

3.4结果与讨论 21

3.4. 1蛋白含量的测定 21

3.4.2组羰基还原酶YlCR1的酶活研究 22

3.4.3 OPBE及R-HPBE的气相分析方法的建立 22

3.4.4 OPBE和R-HPBE气相分析标曲的制备 23

3.4.5辅酶NADPH标曲的制备 24

3.3.6重组羰基还原酶对OPBE的不对称还原。 25

3.5本章小结 26

第四章 结论与展望 27

4.1主要结论 27

4.2展望 27

参考文献 28

致谢 32

第一章 绪论

1.1 手性化合物

手性是自然界普遍存在的现象，是指一个物质实体与其镜像不能重合的特征，正如人的左右手一样，故而称为手性^[1]。在立体化学中，不能和其镜像结构重叠的分子叫做手性分子，两者之间互为对映异构体^[2]。一对对映异构体在非手性环境下，拥有着很多相同的物化性质，但在手性环境中，一对对映异构体就会出现很多差别，如在人体内，一对对映体的化学、生物和药理活性功能及代谢速率、毒性等会存在明显的差异。因此，不同手性的两种对映体通常被人们认定为是两种化合物。1992年5月，美国食品药品监督管理局首先颁布了关于严格限制外消旋化学品使用的法规，鼓励医药企业开发出售单一异构体形式的外消旋体药物 ^[3]。因此，制备手性产品成为目前很多研究者的工作重心。

1.2 手性醇类化合物

在手性化合物中，被广泛关注研究最多的化合物是手性醇。手性醇类化合物是一类在手性碳上连有羟基的的化合物，这类化合物的结构稳定，是应用于很多领域的关键中间体。在农药领域，手性醇可被用做生物信息素、昆虫等性外激素的合成中间体^[4]；在材料科学领域，由于手性醇的旋光性，可以显著提高液晶性能。在医药方面，手性醇也被用作很多合成药物前体的手性砌块。

典型手性醇中间体，如：(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(R-HPBE) ^[5]、(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)这两种化合物都是合成我们生活中很熟悉很常见的药物的前体。所以制备很多热门的光学活性的化合物受到了工业生物技术科研工作者的高度重视^[6-8]。

1.3 手性醇的制备方法

1.3.1 化学法

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