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摘 要

本文对利用酿酒酵母改造进行木糖代谢生产乙醇的背景、生产条件、限制因素和生产乙醇的意义进行了叙述。本实验通过提取热带假丝酵母木糖代谢表达基因来改造重组酿酒酵母，使重组的酿酒酵母利用酶使木糖进行代谢发酵。通过一系列的木糖、葡萄糖相同和不同比例的发酵液来培养改造好的酵母菌。然后，再利用分光光度计、气相色谱仪和Agilent高效液相色谱（HPLC）等来测OD₆₀₀、木糖剩余量和生成产物量来筛选出实验改造成功的酿酒酵母和测试实验改造成功的重组酿酒酵母利用木糖来进行木糖代谢的能力。从而，为实现工业化大规模利用酿酒酵母生产乙醇奠定实验基础。

关键词：酿酒酵母 假丝酵母 木糖代谢 乙醇

Effect of xylose reductase and xylitol dehydrogenase on xylose metabolism in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

In this paper, the background, production conditions, limiting factors and the significance of ethanol production were described. This experiment through the extraction of Candida tropicalis BY4741 xylose reductase and xylitol dehydrogenase xylose metabolic enzymes required for gene expression to transformation of Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces cerevisiae can make use of xylose fermentation was carried out. Through a series of xylose, glucose, the same and different proportion of the fermentation broth to cultivate a good yeast. Then the spectrophotometer, gas chromatograph and Agilent high performance liquid chromatography (HPLC) to measure the OD600, xylose remaining amount and production quantity to screen out and improving the success of Saccharomyces cerevisiae and test the improvement of recombinant Saccharomyces cerevisiae xylose utilization of xylose metabolism ability. Thus, it provides a powerful experimental basis for the realization of large-scale industrial production of ethanol by Saccharomyces cerevisiae.

Key Words: Saccharomyces cerevisiae; Candida albicans; Xylose metabolism; ethanol

目 录

摘 要 I

Abstract II

第－章 文献综述 1

1.1木糖代谢的研究背景 1

1.2 酿酒酵母的研究特点 2

1.3木糖还原酶（XR） 3

1.4木糖醇脱氢酶（XDH） 3

1.5木糖代谢的催化机理 3

1.6影响因素 5

1.6.1 pH值和温度 5

1.6.2 底物抑制 6

1.6.3 辅酶 6

1.6.4 重组酵母自身限制性 6

1.7 研究目的 7

第二章 改造酿酒酵母的木糖发酵实验 8

2.1 前言 8

2.2 缩略词表 8

2.3 实验材料和仪器 9

2.3.1菌株与质粒 9

2.3.2实验仪器 9

2.3.3实验试剂 10

2.3.4种子液 11

2.3.5发酵液液 11

2.4 实验方法 11

2.4.1 重组酿酒酵母种子的活化 11

2.4.2发酵液的配置和接种 12

2.4.3发酵液的取样和培养 12

2.4.4样品处理 12

2.4.5测试发酵液糖含量 13

2.4.6 BY-XR-(PGK-XDH-CYC)重组酿酒酵母种子的活化 13

2.4.7配制发酵液 13

2.4.8发酵液的取样和培养 14

2.4.10样品测OD₆₀₀和打样 14

2.4.11 Agilent高效液相色谱（HPLC） 14

2.4.12 气相色谱 15

2.5本章小结 15

第三章 结论与展望 16

3.1 结论 16

3.1.1 实验结果与讨论 16

3.1.2 结论 21

3.2 展望 21

参考文献 23

致 谢 26

第－章 文献综述

1.1木糖代谢的研究背景

20世纪以来，多次石油危机和环境问题，使得资源、能源等的储存提供以及保护环境已经成为现在人类所需要面对的共同问题，这也成为影响世界经济发展和社会安全稳定的重要问题^[1]。随着石油、煤炭等大量不可再生资源被世界上的传统化工产业消耗，这些资源日益枯竭，因此当今世界提出了寻找新的可替代能源的艰巨任务^[2]。乙醇作为洁净无污染的新可再生能源，可以很好的满足时代的需要。

作为传统工艺获得的最古老的产品——乙醇，人类利用它的历史非常悠久，乙醇的应用遍及食品饮料、化工原料和燃料等多个领域。乙醇作为基础的化工原料，已经衍生出如乙烷、乙烯、聚乙烯和苯等等多种不同化工产品^[3]；与此同时，作为重要的有机溶剂，常常被用于生活、生产的多个方面如：卫生医药品、洗涤剂、工业溶剂、专用溶剂、稀释剂和表面涂料溶剂等。

发酵法和化学合成法是生产乙醇的主要方法^[4]。化石原料天然气和煤炭是化学合成法的原料。随着现代经济的发展，合成法已经不符合当前经济发展的潮流，同时，合成法合成的化学乙醇中含有如：异构高碳醇等多种会对人体高级神经中枢有麻痹作用的化学物质，不太适于制作饮料、食品、医药和香料等生活、医疗用品。以生物质为原料转化得到的乙醇叫做生物乙醇，是一种至关重要的生物质能源^[5]。生物乙醇由于其的可再生和环保性，已日益受到广泛的关注^[6]。

微生物细胞具有较高的环境适应能力、较好的繁殖能力和高规律性的代谢网络，但是自然界细胞的代谢网络往往不能获取人们所期望的产量，因此我们需要改变微生物细胞的代谢网络。

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