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摘 要

氧化还原酶作为酶的六大类型之一在催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等重要化工原料及医药中间体方面显示了极大的优势，受到研究者的广泛青睐。磷酸化的3-磷酸甘油醛脱氢酶（EC 1.2.1.9）（GAPN）是不可逆地催化3-磷酸甘油醛（GAP）变为3-磷酸甘油酸的氧化反应（3-PG或3-PGA），同时将NADP 还原为NADPH。GAPN用于糖酵解途径的变体，将能量保存在NADPH中而不是ATP中。研究非磷酸化的磷酸甘油醛脱氢酶对于加速糖酵解反应具有重要的意义。

本文扩增了Streptococcus thermophiles中的非磷酸化的3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPN。在大肠杆菌中成功表达后对底物GAP的活性为27.2 U/mg protein。StGAPN的酶学性质表明：最适反应pH 7.0，最适反应温度为55 ºC，Gu2 对StGAPN的活性有很强的抑制作用，其他的一些金属离子如Ba² 、Mn² 、K 、Li 、Na 、Zn² 、 Mg² 以及螯合剂EDTA对酶的活性基本没有影响。

关键词：GAPN酶 克隆表达 纯化 酶学性质

Cloning, expression and separation and purification of

unphosphorylated glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase

Abstract

As one of the six major types of enzymes, the redox enzyme shows great advantages in the preparation of chiral alcohols, hydroxy acids, amino acids and other important chemical raw materials and pharmaceutical intermediates, which has been widely favored by researchers. Phosphorylation of glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (EC 1.2.1.9) (gapn) is not reversible catalytic glyceraldehyde 3-phosphate (GAP) variable for 3-phosphoglyceric acid oxidation reaction (3-PG or 3-pga). At the same time, NADP is reduced to NADPH. GAPN is used as a variant of the carbohydrate fermentation pathway, which is stored in NADPH instead of ATP. The study of the non phosphorylated phosphate dehydrogenase is of great significance to accelerate the fermentation of the fermentation of sugar.

In this paper, the non phosphorylated 3- phosphate dehydrogenase GAPN in thermophiles Streptococcus was amplified. The activity of substrate GAP was 27.2 protein after successful expression in E. coli. StGAPN the enzymatic properties of showed that: the optimum reaction pH 7.0, the optimal reaction temperature is 55 degrees C, the activity of StGAPN Gu2 has a strong inhibitory effect, some other metal ions such as Ba2 , Mn2 , K , Li , Na , Zn2 , Mg2 and chelating agent EDTA on the enzyme activity had no effect.

Keywords:GAPN;Cloning and expression;Purification;Characterization of GAPN

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1嗜热链球菌的简介 1

1.1.1嗜热链球菌的性质 1

1.1.2嗜热菌应用前景 1

1.2 非磷酸化的磷酸甘油醛脱氢酶（GAPN）的性质 2

1.3 非磷酸化的磷酸甘油醛脱氢酶（GAPN）的催化途径 2

1.4 国内外研究现状和研究成果 2

1.5 GAPN的理化性质 4

1.5.1 最适pH值及pH稳定性 4

1.5.2 最适温度及热稳定性 4

1.6 本课题的立题背景、意义及研究内容 4

第二章 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验试剂 6

2.1.2 菌株、质粒、工具酶、分子量标准和试剂盒 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 非磷酸化的3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPN在大肠杆菌中的克隆和表达 8

2.2.2 重组NADH氧化酶的纯化 10

2.2.3 GAPN的生化性质研究 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 StGAPN基因GAPN的克隆和表达 12

3.1.1嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）基因组的提取 12

3.1.2 目的基因的获取及重组菌的构建 12

3.1.3 pET-28a-GAPN的表达和酶活性分析 13

3.2重组StGAPN的纯化 14

3.3 酶学性质的研究 15

3.3.1 pH对StGAPN活性和稳定性的影响 15

3.3.2 温度对StGAPN活性和稳定性的影响 16

3.4.3 化学试剂对StGAPN的影响 17

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致 谢 23

第一章 文献综述

这些年来，在催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸额时候，氧化还原酶起到了日益重要的作用，并且应用在制药、食品、精细化工、农药等领域也越来越多因此人们对这种类型酶的研究也日益增多。氧化还原酶在进行生物催化反应时需要消耗一定量的辅酶，然而，所消耗的辅酶的价格有时甚至比生物催化反应所得产物的价格还要高，并且其重复利用性和稳定性害不尽如人意。非磷酸化的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPN）是不可逆地催化3-磷酸甘油醛（GAP）变为3-磷酸甘油酸的氧化反应（3-PG或3-PGA），同时将NADP 还原为NADPH。GAPN用于糖酵解途径的变体，将能量保存在NADPH中而不是ATP中。

1.1嗜热链球菌的简介

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