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摘 要

脂肽surfactin是一类由1个七氨基酸缩肽和1个β-羟基脂肪酸两部分组成的生物表面活性剂，是芽孢杆菌产生的一种次级代谢产物，具有可降解、低毒特点，在环境修复、动物养殖、医药领域等新型中有着广泛应用前景。但是由于生产成本大、产量低等原因限制了该生物表面活性剂的工业应用。细菌生产脂肽surfactin由非核糖体肽合成酶（NRPS）、脂肪酸合成、sfp蛋白三大模块组成。枯草芽孢杆菌BS168由于sfp蛋白编码基因的突变导致sfp蛋白失活，因而无法生产脂肽surfactin。通过基因工程手段，构建了组成型的强启动子P43与溶氧诱导型的启动子Pvgb控制的sfp蛋白表达质粒，导入到BS168中，使得BS168产surfactin，并且产量可以达到110mg/L。验证了通过控制sfp蛋白的表达可以控制surfactin的生产，为后面实验提供依据。

关键词：启动子 细菌基因组 sfp蛋白 合成途径 surfactin

Construction of lipopeptide Surfactin pathway based on promoter engineering

Abstract

Liposide surfactin is a kind of biosurfactant composed of one seven amino acid peptide and one β-hydroxy fatty acid. It is a secondary metabolite produced by Bacillus, which has the characteristics of biodegradable and low toxicity. Environmental remediation, animal breeding, medicine and other new applications have a wide range of applications. However, due to the large production costs, low yield limits the industrial application of the biosurfactant. Bacteria production lipopease surfactin non-ribose peptide synthesis enzyme (NRPS), fatty acid synthesis, sfp protein three modules. Due to mutations in the sfp protein-encoding gene leads to inactivation of sfp protein, and thus Bacillus subtilis BS168 can not produce lipopeptides surfactin. The recombinant plasmid P43 and the promoter of Pvgb-controlled sfp protein were constructed by genetic engineering. The recombinant plasmid P43 was constructed into BS168, which made BS168 surfactin and reached the yield of 110mg / L. It was verified that the expression of surfactin could control the production of sfp protein and provide the basis for the later experiments.

Key Words: promoter; bacterial genome; sfp albumen; synthesis pathway; surfactin

目 录

摘要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

目 录 Ⅲ

第一章 引言 1

1.1 脂肽Surfactin的概述 1

1.1.1 脂肽Surfactin的结构和性质 1

1.1.2 脂肽Surfactin的应用 1

1.2 脂肽Surfactin的合成途径 2

1.2.1 合成的启动 3

1.2.2 合成的起始 3

1.2.3 肽链的延伸 3

1.2.4 肽链的环化 3

1.3 细菌启动子工程 4

1.3.1 启动子概述 4

1.3.2 启动子分类 4

1.3.3 启动子在代谢工程中的应用 4

1.4 本文研究的目的和意义 5

第二章 实验材料与方法 6

2.1 材料与仪器 6

2.1.1 菌株和质粒 6

2.1.2 实验试剂 6

2.1.3 工具酶、分子量标准和试剂盒 7

2.1.4 实验仪器 7

2.1.5 培养基 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 重组质粒pHY300-P43-sfp的构建 9

2.2.2 重组质粒pHY300-Pvgb-sfp的构建 13

2.2.3 构建BS168-pHY300-P43-sfp和BS168-pHY300-Pvgb-sfp菌株 14

2.2.4 重组菌的发酵 15

第三章 结果与讨论 16

3.1重组质粒pHY300-P43-sfp的构建 16

3.1.1 sfp基因的获取 16

3.1.2 P43基因的获取 16

3.1.3 构建P43 sfp片段 17

3.1.4 重组质粒pHY300-P43-sfp的构建 18

3.2 重组质粒pHY300-Pvgb-sfp的构建 18

3.2.1 pHY300载体PCR 18

3.2.2 构建pHY300-Pvgb-sfp重组质粒 19

3.3 不同重组菌的发酵研究 19

第四章 总结与展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 引言

1.1 脂肽Surfactin概述

1.1.1 脂肽Surfactin的结构和性质

Surfactin是由1个七肽和1个β－羟基脂肪酸构成的。Surfactin 在水相中以及在气水界面上呈马鞍型，由于Surfactin具有紧密拓扑结构,由于这个拓扑结构，使得Surfactin同时具有轻微的亲水能力。

Surfactin 有着良好的稳定性和表面活性，这得来于其两亲性化学结构。并且实验研究发现，经过2h的121 ℃高温处理，Surfactin的乳化能力和表面活性仍旧保持稳定[1]。和许多化学合成的表面活性剂Surfactin相比较，Surfactin的结构和理化性质表现出了更高的优秀程度。但是Surfactin的安全性还没有得到保证，于是为了测试出其安全程度如何，Hwang等[2]对Surfacrin的生理毒性进行的研究表明脂肽Surfactin对生物的生理毒性很低，安全性比较高。

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