论文总字数：13575字

2017 届毕业设计（论文）

题 目：利用木糖的酿酒酵母菌株的构建及辅因子扰动对其发酵过程的调控  

专 业： 生物工程

班 级： 生工1302

姓 名： 黄 谦

指导老师： 陈 勇

起讫日期：2017/4-2017/5

2017年 5 月

1. 酿酒酵母的改造背景

本文对利用酿酒酵母改造进行木糖代谢生产乙醇的背景、生产条件、限制因素和生产乙醇的意义进行了叙述。本实验就是针对酿酒酵母BY4741进行分子改造，使得本来不可以利用的木糖的BY可以利用木糖，来改造重组酿酒酵母，使重组的酿酒酵母利用酶使木糖进行代谢发酵。通过一系列的木糖、葡萄糖相同和不同比例的发酵液来培养改造好的酵母菌。然后，再利用分光光度计、气相色谱仪和Agilent高效液相色谱（HPLC）等来测OD₆₀₀、木糖剩余量和生成产物量来筛选出实验改造成功的酿酒酵母和测试实验改造成功的重组酿酒酵母利用木糖来进行木糖代谢的能力。从而，为实现工业化大规模利用酿酒酵母生产乙醇奠定实验基础。

关键词：酿酒酵母by4741 木糖代谢 乙醇

Effect of xylose reductase and xylitol dehydrogenase on xylose metabolism in Saccharomyces cerevisiae

文 献 综 述

1. 概述

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是工业上生产乙醇的优良菌株，较之细菌，具有较高的乙醇耐受力，对木质纤维素水解液中的抑制物也有较高的抗性[1]。 纤维素原料经预处理后有很大一部分半纤维素降解成木糖，虽然酿酒酵母以其高效的产乙醇能力和较强的乙醇耐受性成为目前广泛使用的乙醇生产菌， 但由于它们都不能利用木糖，故用作木质纤维素乙醇生产菌的优势并不明显[2]。

酿酒酵母菌缺乏有效转化木糖生成木酮糖的酶而不能利用木糖，但能利用木糖的异构体形式—木酮糖。自然界中由木糖转化为木酮糖的代谢途径有两条：其一，主要在某些酵母及丝状真菌中，木糖经木糖还原酶(xylose reduce ， XR)催化生成木糖醇，然后由木糖醇脱氢酶(xylitol dehydorgenase ，XDH)作用生成木酮糖，XR和XDH分别需要NADPH和NAD 作为辅酶。其二，在某些细菌和低等真菌中，木糖通过木糖异构酶(xylose iosmerase，Xl)催化，直接转化为木酮糖。木酮糖经过木酮糖激酶(xylulokinase ， XK)磷酸化生成5-磷酸木酮糖，从而进入磷酸戊糖途径。

本实验就是针对酿酒酵母BY4741进行分子改造，使得本来不可以利用的木糖的BY可以利用木糖。

1. 木糖代谢的主要三种酶

1.木糖还原酶（XR）

木糖还原酶是木糖代谢的关键酶，催化木糖到木糖醇的反应。木糖还原酶由Xyll基因编码，已经从多种酵母中得到了克隆并在各种宿主菌中得到了表达。Xyll基因在树干毕赤酵母菌CBS5773[3]，CBS5774[4]和CBS6054[5]中克隆得到并测序，该基因的开放阅读框架为954bp，编码318个氨基酸，蛋白质分子量为35.973kD，木糖还原酶的天然状态为二聚体形式[6]。在热带假丝酵母中，该基因的开放阅读框架为972bp，编码324个氨基酸，蛋白质分子量为36.692kD，以单体形式存在[7]。目前，木糖还原酶基因的生理作用在一些利用术糖的主要酵母中己经进行了较深入的研究，可以根据木糖还原酶对辅因子的特异性将酵母分为两大类。热带假丝酵母，树干毕赤酵母，白色念珠菌)均为双辅酶，但是对NADPH亲和力较大。木糖还原酶对NADH的依赖性对于木糖代谢是至关重要的，因为木糖代谢的第二步的术糖醇脱氢酶是NADH专一性的，如果木糖还原酶以专一的NADPH为辅因子，除非有其它的再生NAD 方式存在，否则就会引起细胞内辅助因子的不平衡[8，9]。木糖还原酶受木糖诱导，受葡萄糖和甘露糖的阻遏[10]。

2.木糖醇脱氢酶（XDH）

木糖醇脱氢酶氧化木糖醇生成木酮糖是木糖代谢的第二步，术糖醇脱氢酶为NAD 依赖型，只有利用NAD 才能完成此步反应。木糖醇脱氢酶基因xyl2已经从树干毕赤酵母[11]和热带假丝酵母[12]中克隆得到并测序。该基因的开放阅读框架为lo89bp，编码363个氨基酸。木糖醇脱氢酶的天然状态为二聚体形式，推测其在树干毕赤酵母中的分子量为63kD(2x32kD) [13]，在热带假丝酵母中的分子量为82kD(2x40kD) [14]。D-糖和L-阿拉伯糖对木糖醇脱氢酶基因xyl2都有诱导作用[15]，相较而言L-阿拉伯糖xyl2的诱导作用更强，但是木糖醇对该酶没有诱导作用。与木糖还原酶的双辅助因子依赖性不同，木糖醇脱氢酶是NAD 专一性的。木糖醇脱氢酶基因xyl2含有一个保守的NAD 结合区域，该结合区域含有GXGXXG腺嗓吟结合部位[16]。

3.木酮糖激酶（XK）

木糖代谢第三步反应是木酮糖到5-磷酸木酮糖，由木酮糖激酶(Xks)催化，木酮糖激酶由xksl基因编码，己经从酿酒酵母，树干毕赤酵母和热带假丝酵母中克隆出该基因，并且报道了其开放阅读框架为1803bp，编码600个氨基酸[17-20]。对于真核生物的Xks的基础研究相对较少，对于木糖发酵酵母而言，Xks活性受木糖诱导，其活性是葡萄糖条件下的10到20倍[21]。

1.1影响因素

酵母发酵生成乙醇受生化活动和环境条件影响，发酵过程只能调控环境条件。影响木糖发酵主要：培养基成分优化、接种量、时间、环境、通气量等等。

1.1.1 pH值和温度

酿酒酵母生长在偏酸性环境中,温度不能太高。酵母水解发酵植物纤维时，pH值应当提高。在酸性条件下,水解液中的醋酸对酵母的抑制作用变强。

1.1.2 底物抑制

菌株的乙醇耐受力是限制木糖被发酵利用的另一个关键的原因。不同菌株的乙醇的耐受力都不同，耐受性也受到培养温度和培养基碳源性质的影响。

1.1.3 辅酶

辅酶在分解和合成代谢中发挥重要作用。需要两种辅酶（NADPH和NAD ）的参与到木糖代谢的过程中，木糖还原酶辅酶将木糖转化为木糖醇，木糖醇脱氢酶辅酶转化木糖醇变为木酮糖。因为不同反应需要不同辅酶，导致辅酶氧化还原电势不平衡，使中间产物木糖醇的积累，乙醇得率不高。改变辅酶的偏好性是缓解木糖醇积累的有效途径。

利用木糖醇脱氢酶辅酶的结合特异性来重组和改造菌株的发酵研究，发现辅酶平衡只是影响木糖代谢的重要因素之一，木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的活性和比率也十分重要。高活性的辅酶和辅酶合适的比率,也是影响酵母细胞木糖代谢发酵产生乙醇的因素。

利用辅酶工程来改造细胞内的辅酶比率,使酿酒酵母更加有利于利用木糖进行代谢发酵。

1.1.4 重组酵母自身限制性

重组酵母菌株木糖发酵受制约的因素:（1）酵母磷酸戊糖途径局限性。与木糖代谢的野生菌株相比，改造菌株中的转醛酶和转酮酶活太低，导致木糖磷酸化不能很好进入糖酵解途径，从而使得木糖更多的流向氧化代谢途径^[18] 。（2）“氧化还原电势失衡”学说。因为毕赤树干酵母中的木糖还原酶具有的NADPH依赖的偏好性，使木糖醇脱氢生成的NADH只有部分甚至不能作为XR的辅酶用于催化木糖还原生成木糖醇，使得余下的NADH经呼吸链氧化维持细胞的氧化还原电势平衡，这样造成了细胞内的氧化还原电势失衡。（3）酿酒酵母菌本身木糖跨膜转运的制约^[19]。

1.2.1 研究目的

酿酒酵母能在无氧条件下充分高效的利用葡萄糖来发酵生成乙醇，有较高的乙醇得率，并且发酵得到的副产物较少。但是，酿酒酵母完全不可以利用木糖单糖进行发酵生产。然而，热带假丝酵母菌株能高效的利用木糖进行发酵生成乙醇。因为假丝酵母中含有木糖代谢酶的表达基因，可表达生成木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，使得热带假丝酵母可以自身代谢利用木糖氧化—还原生成木酮糖，从而戊糖磷酸途径利用木酮糖发酵生成乙醇。实验将热带假丝酵母中的木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）的表达基因导入到酿酒酵母中，使得XR和XDH能在酿酒酵母中可以表达生成木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，进而可利用木糖发酵反应从而自身发酵生成乙醇。然后把导入不同基因的酿酒酵母放入相同发酵液中，和一种酿酒酵母放入不同比例的木糖和葡萄糖的发酵液中进行检。从而，实现让原本不能利用木糖的酿酒酵母可以利用木糖发酵生成乙醇。

第二章 改造酿酒酵母的木糖发酵实验

2.1 前言

目前，由于不可再生资源的日益减少和环境问题的日益严重，乙醇作为－种可再生的环保能源成为人们日益关注的资源。而微生物通过发酵生成乙醇就成为生产乙醇的重要途径。木糖由于在自然界中大量存在成为生成乙醇的很好资源，但是大部分微生物无法利用木糖。而重组微生物成为生物利用木糖的重要方法之－。酿酒酵母因其自身较大乙醇得率和很高的乙醇耐受性成为实验重要和首要的实验目标。通过基因导入生成重组酿酒酵母。重组酵母菌的木糖代谢的第一步是由木糖还原酶催化木糖转变为木糖醇，木糖代谢的第二步是由木糖醇脱氢酶催化木糖醇转变为木酮糖，再通过糖降解途径把木糖醇反应成乙醇。

本实验通过导入BY4741中的木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）表达生成3中改造菌株：BY-XR-PXDH,BY-XR-PXDH-XK，BY-XR-PXDH-NOXE。将原始菌株、BY4741获得的3种重组酿酒酵母储存于-80℃的超低温冰箱中，实验时通过摇床和种子液活化，再通过利用不同比例的葡萄糖和木糖的发酵液在摇床中培养BY-XR-(PXDH，PXDH-XK，PXDH-NOXE)重组酿酒酵母菌选出最适的培养葡萄糖和木糖比例，及使用相同比例的葡萄糖和木糖比例培养6种酿酒酵母得到最优的重组酿酒酵母。

2.2 缩略词表

表2-1 词表

Table 2-1 Thesaurus

2.3 实验材料和仪器

2.3.1菌株与质粒

表2-2 菌株

Table 2-2 Strains

2.3.2实验仪器

表2-3 主要设备及仪器

Table 2-3 Main equipments and instruments

续表 2-3

Continued table 2-3

2.3.3实验试剂

表2-4 实验试剂

Table 2-4 Reaction reagents

2.3.4种子液

重组酿酒酵母使用的种子液（g/L）400ml :葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠9，pH调至5.2～5.4,高压蒸汽灭菌锅115°C(1.034×10⁵Pa)，20min。

2.3.5发酵液

重组酿酒酵母使用的木糖发酵的发酵液（g/L）：（1）纯葡萄糖：葡萄糖60，酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠9，pH调至5.2～5.4,高压蒸汽灭菌锅115°C(1.034×10⁵Pa)，20min。（2）混合糖：葡萄糖20，木糖40，酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠9，pH调至5.2～5.4,高压蒸汽灭菌锅115°C(1.034×10⁵Pa)，20min。（3）纯木糖：木糖60，酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠9，pH调至5.2～5.4,高压蒸汽灭菌锅115°C(1.034×10⁵Pa)，20min。

2.4 实验方法

2.4.1 重组酿酒酵母种子液的活化

实验用的重组酿酒酵母菌株保存于-80℃的超低温冰箱中，所用菌种来自上述表2-1。

取存于-80℃冰箱中的保存的甘油菌于装有5mL种子液的50mL的离心管中放入30℃的摇床中以200rpm培养22-24h，转接到装有100mL种子液的500mL三角瓶里， 30℃ 200rpm培养20h。

2.4.2发酵液的配置和接种

实验改造菌种共3种，实验需要配置3瓶纯葡萄糖发酵液和混合糖发酵液，共6瓶。先用1L烧杯配置800ml纯葡萄糖的发酵液（g/L）：（1）葡萄糖60，酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠90，pH调至5.2～5.4,高压蒸汽灭菌锅115°C(1.034×10⁵Pa)，20min。（2）再用1烧杯配置800ml混合糖发酵液（g/L）：葡萄糖20，木糖40，酵母粉5，蛋白胨10，氯化钠9，pH调至5.2～5.4,高压蒸汽灭菌锅115°C(1.034×10⁵Pa)，20min。

在超净工作台上，用1000μL的移液枪依次对6瓶发酵液进行接种，接种到纯葡萄糖发酵液和混合糖发酵液中，并依次对接种10％酵液进行标记，标明无木糖和有木糖。

2.4.3发酵液的取样和培养

实验分别对6瓶无木糖和含木糖的发酵液用移液枪进行取样：（1）0h的样品取样用5mL的移液枪取5mL的样分别打入10mL离心管中。（2）0h后的样品每次取样用5mL的移液枪取1mL的样加入10mL的离心管中。取样完成，对离心管进行标记，标注纯葡萄糖和混合糖。然后把6个10mL离心管放入高速离心机中以4500rpm离心10分钟。同时，三角瓶放入32°C的摇床中以200rpm摇晃连续培养。对发酵液每12小时进行－次取样。

2.4.4样品处理

样品离心后，用100μL移液枪取上清液100μL加入有1900μL纯水的2mL离心管中，摇匀，用1mL的一次性针筒过0.22μ水系的滤膜，缓慢注入液相小瓶当中，标记，标明天数，放入4°C的对开门冰箱中冷冻保存，待测。

菌株的浓度的测定－般采用分光光度计测定法，将取样试剂充分摇匀，加入9.1ml的水稀释（一般将取样的发酵液稀释到－定的倍数，以分光光度计读数为0.2-0.8为宜），以在600nm下的吸光度来标定发酵液中的菌株的浓度。

2.4.5测试发酵液糖含量

在超净工作台上用1000μL的移液枪取1000μL的样品加入到2mL的离心管中，在高速离心机中以4500rpm离心10分钟，然后，在2mL离心管中取500μL的上清液加入到10mL的离心管中接着再加入500μL的DNS，混匀，放入水浴锅中用沸水加热5分钟，取出，放入冷水中等待降温，待不烫手后往10mL离心管中加入8mL的纯水，混匀。将分光光度计的波长调到540nm，测试吸光度。

2.4.6 Agilent高效液相色谱（HPLC）

1）样品预处理

将样品于Eppendorf 离心管4500rpm离心10min。取上清按检测作20倍稀释，直接取样稀释过膜加入液相小瓶中。各标品浓度－般均为10 m mol/L。

2）伯乐有机酸柱检测

流动相：5mM的H₂SO₄

柱温： 50℃；检测波长：210nm紫外检测（或者示差折光）；

进样量：10ul；流速0.4ml/min

2.4.7 气相色谱

1）样品预处理

将样品于Eppendorf 离心管4500rpm离心10min。取上清按检测作20倍稀释，直接取样稀释过膜加入液相小瓶中。各标品浓度－般均为10 m mol/L。

2）操作

a:接通电源开启气象色谱仪和积分仪的电源开关。b：开启气路阀门，N₂和H₂的压力定在3—4atm，气体压缩机的电源开关对气路流量进行调节。各气路的流量为：载气（N₂）105—2 ml/min,H₂ 60—70 ml/min,空气250—300 ml/min。c：温度控制系统的调节，调整汽化室温度为180℃，检测器的温度为220℃，加热温度调至70℃。当仪器温度到所调温度时，点燃检测器的氢火焰，进行样品分析，通过电脑点“Run Sequence”进行自动进样。

2.5本章小结

通过基因工程技术将热带假丝酵母的木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）表达基因导入酿酒酵母中，改变酿酒酵母的启动子变为代谢利用木糖的强启动子。实验通过相同木糖和葡萄糖比例的发酵液对6种酵母菌株进行发酵实验，其中0-1，0-2号分别为未改造的酿酒酵母和BY4741，通过对发酵液中木糖残存量和木糖醇、甘油和乙酸生成量的检测，比较。从而筛选出可利用木糖的改造的酿酒酵母。经过实验计算，实验最终筛选出的3-1、1-2号菌株是成功改造能很好利用木糖进行代谢生成乙醇的重组酿酒酵母。

第三章 结论与展望

3.1 结论

3.1.1 实验结果与讨论

1）6种菌株的OD₆₀₀

图3-1菌株在混合糖发酵液的OD₆₀₀

Fig.3-1 OD₆₀₀ in mixed sugar fermentation broth1-2的OD值比3-1高，这说明了在1-2的基础上再表达TAL并没有得到更好的表达效果，所以后续的糖比例的实验我们选择1-2号菌。

表3-1 菌株

Table 3-1 Strains

2）6种菌株的生成产物

图3-2 发酵液木糖剩余量

Fig.3-2 Residual amount of xylose in fermentation broth这个可以看出1-1、3-2不利用木糖外，其他的菌株都利用木糖，而3-1、1-2利用木糖效率更高，是改了启动子的，这也体现出了强启动子对XR和XDH表达的影响。

图3-3 木糖醇生成量

Fig.3-3 Xylitol production

图3-4 甘油生成量

Fig.3-4 Glycerol production

图3-5乙醇生成量

Fig.3-5 Acetic acid production

改造菌株在混合糖中发酵时，BY-XR-PXDH-XK-1发酵乙醇产量高。在相同条件下，BY-XR-PXDH-NOXE-2的乙醇产量更高。BY-XR-PXDH-XK-1的甘油产量与BY-XR-PXDH-NOXE-2相差无几。

在XR,XDH的基础上继续表达XK对BY菌株利用木糖的能力影响不错。继续表达noxE-1后，改善更加明显。在NOXE-2的基础上再表达TAL，对菌体生长和产物形成的影响不大。但是，将PXDH-2的启动子从TEF换成PGK后，不仅菌体生长得到促进，木糖消耗也增加，但是副产物木糖醇大量产生。

3）BY-XR-PXDH-NOXE不同糖比例OD₆₀₀

图3-6菌株OD₆₀₀

Fig.3-6 Strain OD₆₀₀

图3-7对照相菌株OD₆₀₀

Fig.3-7 Control phase strain OD₆₀₀

表3-2 木糖和葡萄糖糖比例

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