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摘 要

工程酶的理性设计与改造一直是生物技术中的核心课题，其中预测蛋白质的多个位点的突变关联效应则是理性设计中的关键技术之一。为此，本文基于分子动力学模拟计算与蛋白质拓扑网络派系社团分析发展了一种预测双突变关联效应—双突变加和性的计算模型，简称为派系模型。本文通过与13个T4噬菌体溶菌酶双突变的实验数据比较，发现派系模型能够比较准确地区分可加和突变与不可加和突变。通过进一步对照具有不同拓扑构象的eglin c蛋白的双突变实验数据，我们发现派系模型也能够部分地解释该蛋白的双突变加和性效应。计算表明，蛋白质双突变的加和性可能与位点的整体联系紧密程度相关，而这个紧密程度可以通过拓扑网络的派系社团表征，而与位点之间具体的氨基酸作用类型与强度的关系不明显。

关键词： 双突变 加和性 网络 k-派系社团

Study on the Network Model of T4 Phage Lysozyme Mutation Effect

Abstract

Rational design is one of the most challenging tasks in the field of enzyme engineering, of which predictions of mutation correlations play a key role. Here, we developed a model, called topology clique model, to predict the correlation between two mutations or the dual mutation additivity, based on the molecular dynamic simulations and the topology clique analysis. We analyzed 13 dual mutations of T4 phage lysozyme and found that the model perfectly isolated additive dual mutations from those non-additive ones. We further examined the model with a topology distinct Eglin c protein, and found that the model still performed fairly well. Our calculations revealed that the correlation between two mutations might depend on the overall connectivity between mutation sites, which can be characterized by topological cliques and have little to do with the detailed interactions between them.

Key Words: Double Mutant; Additivity; Network; K-clique community

目 录

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摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

第二章 文献综述 2

2.1 T4噬菌体溶菌酶 2

2.1.1 功能 2

2.1.2 蛋白质结构和关键位点 2

2.1.3 催化机理 2

2.2 突变效应 3

2.2.1 突变实验数据 3

2.2.2 单点突变的耐受性 4

2.2.3 构造热稳定性增强的突变的方法 5

2.2.4 催化活性位点的稳定性 5

2.2.5 组合突变的加和效应 6

2.3 复杂网络 7

2.3.1 蛋白质结构网络的构建方法 7

2.3.2 基于蛋白质结构网络的研究手段 8

2.4 本研究的目的和思路 8

2.4.1 目的 8

2.4.2 思路 8

第三章 材料和方法 9

3.1 突变实验数据的分析 9

3.1.1 数据的预处理和选取 9

3.1.2 评价双突变的加和效应 9

3.1.3 位点距离对加和效应的影响 9

3.2 分子动力学模拟 9

3.3 氨基酸作用力网络 10

3.3.1 网络的构建 10

3.3.2 网络的拓扑性质 11

3.4 基于3-派系的位点的双突变加和性预测模型 12

3.4.1 基本假设 12

3.4.2 计算步骤 13

3.4.3 模型验证 13

第四章 结果与讨论 14

4.1 双突变加和效应的强弱 14

4.2 位点距离和加和效应的关系 15

4.3 网络拓扑性质和位点加和效应的关系 16

4.3.1 聚类系数 16

4.3.2 K-派系 16

4.4 模型的适用性 18

4.4.1 T4噬菌体溶菌酶 18

4.4.2 Eglin c 19

第五章 结论 20

第六章 参考文献 21

第七章 附录 23

第八章 致谢 24

绪论

理解蛋白质的结构与性质的关系有利于更有效地设计工程酶。多点突变是蛋白质设计常用的方法。通常，如果多个位点突变之间不相互干扰，则它们对蛋白质稳定性的影响是可叠加的。因此，组合一系列略微增加稳定性的点突变就可以大幅地增加蛋白质总体的稳定性。相反，如果多个位点突变之间发生相互干扰，则它们对蛋白质稳定性的影响有可能是不可叠加的。预先计算多个位点之间的加和性强弱，可以有效地减少实验工作量，提升设计效率。然而，现有的理论还不能很好地解释和预测多位点突变关联效应，也就无法给实验提供这方面的指导。

很早，研究者们就注意到了蛋白质突变的可加和性现象。Sandberg^[1]等人就专门对gene V蛋白质的突变加和效应进行了实验研究，发现大部分突变都表现出较强的加和性。另外，他们还发现，参与范德华作用的位点其加和性会有所减弱。Boyer^[2]等人认为远端位点的非加和性预示着氨基酸位点之间的存在信息通讯，并将这种热稳定性非加和现象称为热力学耦合。他们采用原子级别的NMR对天然状态的氢交换进行了观测，尝试确定了两个突变位点之间的扰动范围。他们得到的结论是远端位点的热力学耦合是由蛋白质天然结构中的氨基酸相互作用引起。

复杂网络从系统的角度来考察蛋白质的氨基酸位点之间的联系。前人的研究多集中在网络的拓扑性质差异对酶的热稳定性的影响，至今为止，尚未发现有研究者利用复杂网络研究蛋白质突变的加和性问题。

本文选择T4噬菌体溶菌酶作为研究对象，通过解析它的网络拓扑结构来寻找一种预测位点的加和性特性的方法。为了简化问题，本文只考虑相对于野生型蛋白的双突变，即只考虑双突变位点之情形。首先，我们分析了已有的T4噬菌体溶菌酶的突变效应的实验数据，评估了不同双突变的加和性特性。然后，构造了基于氨基酸相互作用的蛋白质拓扑网络模型，并分析了网络拓扑特征量与位点加和性的关联。最后，我们构造了一种基于网络的数学模型来预测突变位点的加和性强弱的新方法。

文献综述

T4噬菌体溶菌酶

功能

T4噬菌体溶菌酶可裂解细菌细胞壁，使得细菌失去细胞壁的保护而逐渐死亡，可用于核酸提取或重组蛋白提取时细菌的裂解。

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