论文总字数：22965字

摘 要

环磷腺苷（简称cAMP），也被称作“第二信使”，是一种拥有重要生理功能的化合物，参与多种代谢活动。它在医药学和畜牧业也有很大的作用，市场需求量很大，具有良好的应用前景。现在普遍使用高污染、低收率的化学法进行合成，本论文则探索了低污染、高效率的重组大肠杆菌全细胞催化法生产cAMP的工艺。重组大肠杆菌全细胞催化法是生物合成法的一种尝试，这种方法既通过克隆来自cAMP高产菌节杆菌Arthrobacter sp. CGMCC 3584的腺苷酸环化酶基因来提高产量，又利用了大肠杆菌安全无毒、生长快、代谢途径清晰的特点对原来使用诱变型高产菌的方法进行了优化。本文对E. coli BL21（pET28a-cya）与E. coli Rosetta（pET28a-cya）这两株cAMP高产重组菌进行了比较，然后对其中一株菌在1L催化与10L催化中的催化产量进行了验证性与探索性研究。经比较，E. coli BL21（pET28a-cya）的发酵速度较快，而E. coli Rosetta（pET28a-cya）具有更高的催化活性。通过1L催化体系验证，发现E. coli Rosetta（pET28a-cya）cAMP平均产量为12.9g/L，10L催化体系中cAMP产量达到了14.2g/L。

关键词：环磷腺苷 重组大肠杆菌 全细胞催化 催化产量

Production of Cyclic Adenosine Monophosphate by Recombinant E. coli

Whole Cell Catalysis

Abstract

Cyclic adenosine monophosphate (cAMP), which has also been called as "The Second Messenger", is a substance with important physiological activity and involved in a variety of metabolic activities. It is widely used in medicine as well as animal husbandry, and that create the huge market and good application prospects of this cyclic nucleotide. While the usual production of such compound is using the chemistry methods, a way that is high-polluting and low-yield, this paper is searching the process of the recombinant E. coli whole cell catalysis a way that is low-polluted and high-efficiency. As a try of the biosynthesis methods, recombinant E.coli whole cell catalysis does not just increase the yield by clone the adenylate cyclase gene from cAMP high-yield Arthrobacter sp. CGMCC 3584, but also take advantage of the E.coli ,which bacterium is safe, non-toxic, growing fast and has a clear metabolic pathway, to optimize the traditional biosynthesis way used the mutagenic high - yielding bacteria. In this paper, we compare the two cAMP high-yield Recombinant E. coli，which are E. coli BL21(pET28a-cya) and E. coli Rosetta (pET28a-cya), and then confirm and explore the catalytic production of one of them in 1L system and 10L system. We found that while E. coli BL21(pET28a-cya) is better in fermentation speed, E. coli Rosetta(pET28a-cya) has higher catalytic production. To the E. coli Rosetta(pET28a-cya), it could obtain average 12.9g/L in 1L system, and 14.2g/L in 10L system.

Keywords：cAMP；recombinant E. coli；whole cell catalysis；Catalytic production

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 环磷腺苷介绍 1

1.1.1 环磷腺苷的化学特性 1

1.1.2 环磷腺苷在生物体内的形成与灭活 2

1.1.3 环磷腺苷生物学作用 4

1.1.4环磷腺苷医学作用 5

1.1.5环磷腺苷畜牧业作用 6

1.2 环磷腺苷的合成 7

1.2.1 环磷腺苷的化学法合成 7

1.2.2环磷酸腺苷的生物提取法 8

1.2.3环磷酸腺苷的酶法合成 8

1.2.4环磷腺苷的生物合成法 9

1.2.5 环磷腺苷合成方法小结 9

1.3论文立题背景及主要研究内容 10

1.3.1选题背景 10

1.3.2重组大肠杆菌研究进展 11

1.3.3研究内容 11

第二章 重组大肠杆菌全细胞催化生产环磷腺苷 13

2.1 引言 13

2.2实验材料 13

2.2.1菌种 13

2.2.2实验试剂 13

2.2.3实验仪器 14

2.2.4培养基与相关试剂 14

2.3实验方法 15

2.3.1菌株催化活性比较 15

2.3.2 全细胞催化验证 16

2.3.3 全细胞催化体系放大试验 17

2.4分析方法 17

2.4.1 OD的检测 17

2.4.2 cAMP浓度的测定 17

2.5结果与讨论 18

2.5.1 菌株催化活性比较 18

2.5.2全细胞催化验证 20

2.5.3全细胞催化体系放大试验 23

2.6小结 23

参考文献 24

致谢 27

第一章 文献综述

1.1 环磷腺苷介绍

环磷腺苷（Cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP），也同样叫作“第二信使” ，是一类拥有重要生理功能的化合物。这种物质在人体及各种生物体内广泛存在。它对于人体内的各种重要生理功能，如糖原代谢、脂肪代谢、蛋白质合成的调控、基因表达调控、核酸合成等，均发挥着重要的调节作用。临床上，它对于医治心血管、甲亢、神经系统、肝胆等方面的疾病都有一定的疗效。另外，它可作为药物中间体，亦可用于畜禽饲料添加剂。

环磷腺苷的化学特性

cAMP是低分子量（约为329.2）化合物，由一个腺嘌呤、一个核糖以及一个磷酸根化合而成。除此之外，它亦可由三磷酸腺苷（ATP）脱掉两个磷酸缩合生成。能溶于水,对热稳定，所以在中性、微酸和弱碱中煮沸半小时，仍能保持其结构与活性；但在极端条件下水解会使其5'位上的酯键断裂而失活。

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