论文总字数：15057字

摘 要

本文主要介绍了关于花朵状核酸纳米结构的制备及其电化学性能的调控，利用电化学生物传感器检测食品中的肠毒素。实验基于合理设计的单链DNA（ssDNA）和具有特定碱基配对的茎环DNA分子信标探针组装的DNA纳米结构，以此来测定食品中的肠毒素（SEB）。而产生肠毒素的细菌主要是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌等，在日常生活中由于肠毒素导致急性中毒的食品主要为肉类及其副产品，家禽，蛋类，鱼类，冷菜，剩饭等。出现呕吐中毒情况一般是食用了此类被肠毒素感染了的食物以致刺激了患者呕吐中枢，更严重者会损伤人体组织器官甚至危及生命安全。因而在食品安全检测领域不断完善检测肠毒素技术尤为关键，在本文中将会对比各类检测方法的优缺点，以此说明电化学方法的相对优势及其发展前景。也将通过不断改进电化学试验条件如实验中环境温度、缓冲溶液种类以及浓度、反应时间等引起的电信号变化来不断优化实验，最终达到快速准确检测特定目标物的结果。

关键词：金属探针 电化学信号 DNA纳米结构 食品检测 肠毒素

Preparation of flower-like nucleic acid nanostructures and their regulation of electrochemical performance

Abstract

This paper mainly introduces the preparation of the flower like nucleic acid nanostructure and the regulation of its electrochemical performance, and the use of electrochemical biosensor to detect the enterotoxin in food. The experiment was based on a reasonably designed ssDNA and a DNA nanostructure assembled by a DNA molecular beacon probe with a specific base pair. In order to determine the enterotoxin (SEB) in the experimental object. The bacteria that produce enterotoxin are mainly Staphylococcus aureus and Escherichia coli. In daily life, enterotoxigenic food is mainly meat and its products, poultry, eggs, fish, cold food, leftover food and so on. The occurrence of vomiting poisoning is generally used to eat such foods as enterotoxin - infected food to stimulate the patient's vomiting center, more serious people will damage the body organs and even endanger the safety of life. Therefore, it is very important to improve the detection of enterotoxin in the field of food safety inspection. In this paper, the advantages and disadvantages of various detection methods will be compared, and the relative advantages and development prospects of the electrochemical methods will be explained. The results of rapid and accurate detection of specific targets will also be achieved by constantly improving the electrochemical test conditions, such as the changes of the electrical signals caused by the environment temperature, the type of buffer solution, the concentration and the reaction time.

Key words: metal probe; electronic signal; DNA nanostructure; food inspection; SEB

目录

摘要 I

Abstract II

目录 III

正文 1

第一章 绪论 1

1.1引言 1

1.2 检测方法 2

1.2.1动物学实验 2

1.2.2免疫学方法 3

1.2.3分子生物学检测法 3

1.2.4胶体金试纸条检测法 4

1.2.5生物传感器技术 4

1.3发展前景 5

第二章 实验部分 6

2.1实验原理 6

2.2实验试剂及仪器 6

2.2.1试剂材料 6

2.2.2实验仪器 7

2.2.3电化学试验参数 7

2.3实验步骤 7

2.3.1 金电极清洗 8

2.3.2缓冲溶液配制 9

2.3.3电化学传感器构建 9

2.3.4电化学性能调控 9

第三章 结果与分析 11

3.1计时电量法比较信号大小 11

3.2交流阻抗法对比阻抗大小 12

3.3计时电量法对CP_DNA浓度优化 12

3.4孵育SEB的时间优化 13

结束语 15

参考文献 16

致谢 19

正文

第一章 绪论

1.1引言

生物传感器是当下在食品检测领域进行肠毒素检测的重要方法，然而在此类方法中仍然存在诸如放射性污染、仪器昂贵、过程复杂等缺点。因此，相比之下本文所使用的电化学检测方法具有仪器使用简单、实验成本较低、测定迅速准确以及反应灵敏度高等优点，总的来讲电化学基因传感器会是一类优势明显、极具发展前景的检测方法。

本实验主要使用单链DNA（ssDNA）通过共价键合以及化学吸附的方法使其固定在金电极表面^[1]，其次使用巯基乙醇（MCH）对结构不稳定的ssDNA进行封闭。然后通过SEB特异性识别并且结合其核酸适配体，释放出触发DNA，此时触发DNA可以在金电极表面引起链式杂交反应（HCR），最终可以在金电极表面形成大量花状核酸纳米结构，最后再通过增添溶液中的电化学活性物质使其吸附在双链结构表面，达到放大电信号变化的作用。

实验的最终目标待测物肠毒素（SEB）抗原性较强，耐受能力较强在100℃煮沸30 min不被破坏，具有热稳定性即在高温情况下仍然具有致病性^[2]。并且他能够抵抗由胃肠蛋白酶液引起的水解作用，因此能够在消化道中不被破坏。肠毒素主要存在于金黄色葡萄球菌中^[3]，可以说金黄色葡萄球菌无处不在，存在于我们日常生活的每个角落。值得每个人担忧的是，一旦食物保存不当就很容易导致食物中产生一些生物毒素，而肠毒素就是其中一种比较容易滋生的毒素，尤其是在夏季这种季节食物，如果不在较低温的环境下保存的话，就难以长时间储存，那么如果食用了此种保存不当食物，就会出现食物中毒的症状比如呕吐、腹痛、头晕等。至今检测肠毒素的方法层出不穷包括免疫血清学检测技术、聚合酶联反应技术、生物传感器技术等^[4]，然而不管是在发展中国家还是科技相对发达的发达国家，像此类食物中含有细菌引起的食物中毒仍旧是令众多研究人员头疼的问题。本课题综合以往的实验方法进行改良，将纳米技术、核酸杂交技术与简便、灵敏的电化学技术相结合用来制备花状核酸纳米结构的电化学DNA传感器^[5]。

1.2 检测方法

近年来中国食品行业频频发生一些类似于毒奶粉掺假、使用地沟油、饮料中含有塑化剂等等一些食品化学性危害、生物毒素等事件，使得食品安全成为我国热点问题。因此，为保障广大群众的消费以及健康安全，对食品质量安全进行相关检测显得尤为重要。目前，国家不仅加强在食品安全、消费者权益等方面的监管，还加强了具体在食品添加剂、成分、品质、农药残留等方面的立法指标以此来保障广大消费者的安全^[6]。不仅在监管方面，针对食品安全检测方面也是投入了大量的相关科技人才进行相关研究，而针对本文围绕的生物毒素（肠毒素）之前也有相关的检测方法。

1.2.1动物学实验

这是一种原始的生物学敏感实验检测方法，也是较早采用的实验方法。我们通常是使用染毒的食物对小白鼠、家兔、幼猫、猴子等动物进行食物投喂或者在腹腔进行毒素注射实验以及进行皮肤表面的实验^[7]，然而此种方法相对残忍，而且相对来讲使用猴子进行实验准确度较高，但是灵敏度不高并且有的时候需要使用几只猴子进行实验来提高实验准确度，猴子的来源在当下获得也比较困难，因而就在成本以及效率方面大大限制了实验的进程。如若使用小鼠或者家兔也可以用于该方面的实验，但是此类动物敏感性以及选择性较差且操作较为复杂手法残忍。其他非肠毒素类的生物毒素也可导致试验动物幼猫等出现呕吐以及眩晕症状，即出现了假阳性^[8]。虽然在某些实验可以使用该种方法，但是由于此种方法灵敏度不高，结果不准确并且成本较为昂贵，所以逐渐不为采用。

1.2.2免疫学方法

根据大量的文献查阅发现当今大部分的检测肠毒素蛋白的方法都是基于免疫学检测法发展起来的。此种方法也囊括了多种不同的免疫法，其中免疫双扩技术是在定量检测领域最早使用的免疫检测技术，然而该法要求的实验操作水平较高、灵敏度较低、实验中使用的标本量较大即成本较高，所以该方法逐渐不为推广。而众所周知如今最常用的是酶联免疫法（ELISA）,近年来也兴起了一些新方法如荧光免疫技术、反射免疫技术、免疫印迹技术等等^[9]。但是大部分结果不准确，虽然灵敏度高，然而试验操作复杂，仪器使用要求高，因此有些方法也没有得到较好的推广。虽然近年来酶联免疫法使用比较广泛，该方法也具有高敏感性，能直接从食品中检测出肠毒素的优点，但是综合本科中做过的多次实验以及从一些文献中查询到的结果不难发现使用ELISA试剂盒的检测方法经检测范围较小，在肠毒素的分型检测方面应用的也比较少，即只能检测出一般的肠毒素而不能检测出新型的肠毒素，所以我们得知此类方法精确度不高。随着食品安全问题频发，人们对其要求也越来越高，因此我们需要发现并研究一些灵敏度更高的方法来保障食品安全，让消费者放心。

1.2.3分子生物学检测法

该方法是基于聚合酶联技术即为PCR技术上而发展起来的分析法，此种方法简便、快速、特异性强、且易自动化操作，但也存在不能定量分析的缺点。如今应用于检测食品中产生肠毒素的金黄色葡萄球菌的方法不仅仅有一般的PCR技术，还包括灵敏度更高的实时荧光定量PCR技术，这种方法是基于普通PCR技术而衍生出来的核酸定量技术。在实验设计部分，首先是把荧光基团添加到整个实验流程中，其次运用所检测到的信号变化来不断叠加改变条件，然后观察整个反应过程的信号变化，最终由标准曲线来对未知模板进行定量剖析。除此之外，环介导等温扩增反应技术也是一种用来检测肠毒素的分子生物学检测技术，其优点是反应快速、仅需普通仪器、实验操作简单以及效率高^[10]。另外基因芯片技术也能检测多个目标基因，更为灵敏。虽然此类分子生物学检测方法是一些相对新颖的方法，能够提供一些检测的新思路新方向，但是这些方法只是基于核酸水平的检测技术而不能直接应用于肠毒素蛋白的检测，因此该种方法的发展还是有重重阻碍。

1.2.4胶体金试纸条检测法

当下在食品快速检测领域，许多研究人员在着手研究能快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素的试纸条，其中最具代表性的是胶体金试纸条。该试纸条是以胶体金作为标识物，是一种运用特异性反应来进行检测识别，然而目前还是处于一种初级发展阶段的新型标识技术。开发出来的胶体金免疫层析试纸条不仅仅携带方便、使用简单，而且还具备结果易观察等的优点，因此可应用于现场快速检测以及初步筛选。

1.2.5生物传感器技术

目前生物传感技术在食品检测领域迅速兴起，即利用其快速检测出食品中所含有的生物毒素。当下应用于食品检测领域的生物传感器技术主要有电化学免疫传感器技术、压电晶体免疫传感器技术以及光学生物传感器技术等^[11]。本论文实验方法应用的即为电化学生物传感器技术，该方法是综合了生物技术以及电化学技术，方法新颖，灵敏度相对较高且用时短，效率高。而光学生物传感器采用的是光敏元件作为传感器，根据强度、频率等的条件变化的原理，检测出物质中生物毒素的含量^[12]。该种方法最突出的优点即为不需要参比电极，并且实验过程中信号不易受外界干扰即为灵敏度高。另外一种压电晶体免疫传感技术是利用了石英晶体作为传感器，运用其特征阻尼理论能够直接检测液相中的肠毒素。虽然该方法中所使用到的仪器以及实验操作步骤相对简单，但是最大的缺点就是灵敏度较低仅仅能达到0.1 mg/L^[13]，而将来的食品快速检测领域需要的正是灵敏度高、操作简便、效率高、特异性强的以及能够在现场快速检测甚至得到结果的技术，所以该种方法是不能满足食品检测越来越高的要求，很难得到大范围的推广。

1.3发展前景

现如今随着纳米科技、生物科技不断更新发展，电化学生物传感器有望代替一些早前复杂的成本高的结果相对不准确的方法。传统的检测方法通常是需要较为复杂的操作技能、成本较高的仪器以及相关的实验预处理工作，很难达到实现现场快速检测得到结果的要求。相比之下，现如今电化学生物传感器已经一跃成为检测领域较为热门的研究方法，不仅可以直接识别碱基序列和错配序列，具有高灵敏度、成本低廉、反应速度快、反应较为稳定等的优点^[14]，而且本次实验采用的电化学传感器结合了六氨合钌对肠毒素的专一识别功能以及形成花状核酸纳米结构后电化学信号放大的高敏感性，因此具有特异性强、检测分析效率高、微量检样、金电极也可重复使用等特点^[15]。本次试验过程中首先举出合理设计实验的条件，再通过原理验证反复进行电化学性能的调控以及对每次实验的电化学信号的观察以及数据分析来选出较为准确的检测条件，绘制出适用的标准曲线，再对比该数据条件应用于不同生物毒素所产生的电信号变化大小，发现最适用目标待测物肠毒素的检测，所以通过实验步骤不难发现电化学生物传感器所具有的在灵敏度、特异性、效率、成本、操作等方面的优点使得其在不久的将来会有比较好的发展前景，能够得到越来越快速的推广。

实验部分

2.1实验原理

实验中首先通过金硫键作用将CP_DNA固定在金电极表面，再利用MCH封闭CP_DNA的活性位点，通过SEB特异性识别并且结合其核酸适配体，释放出触发DNA，此时触发DNA可以在金电极表面引起链式杂交反应（HCR）^[16]，最终可以在金电极表面形成大量花状核酸纳米结构，再通过在电解液六氨合钌溶液中浸泡2 h增加核酸双螺旋结构表面的电化学活性物质，将微量肠毒素所引起电信号（如电压、电流或电导）进行放大来检测特定目标物，最终根据实验优化的条件达到的较高的选择性来检测样品中是否含有肠毒素及其含量。

2.2实验试剂及仪器

2.2.1试剂材料

TCEP溶液：称取0.0023 g三磷酸（2-氯乙基）酯（TCEP），加入到0.019 mL Tris-HCl buffer中，离心，混合均匀，得到1 mM的TCEP溶液；

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