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摘 要

本文首先在NCBI数据库中查找到Candida tenuis CBS 4435的木糖还原酶基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好对木糖还原酶基因序列进行优化，将优化好的木糖还原酶基因亚克隆到质粒pET28a的ApaI和Xhol酶切位点之间，即构成重组质粒。将构建好的重组质粒通过热激转化导入E.coli BL21（DE3）菌株中，并通过酶切结果得知质粒导入成功。然后将重组大肠杆菌转接于含抗性的 LB液体培养基中进行木糖还原酶的诱导表达，通过超声破碎和离心得到的粗酶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，根据电泳结果表明木糖还原酶诱导表达成功。提取粗酶液用紫外分光光度仪在340 nm处进行酶活的测定，得出粗酶液酶活，最后根据测量的蛋白质含量计算出粗酶液的比活力，为后续酶催化实验的进行做前期的准备。

关键词：木糖还原酶 热激转化 诱导表达 酶活测定

Induced Expression and Activity Detection of Xylose Reductase

ABSTRACT

In this paper, the xylose reductase gene sequence of Candida tenuis CBS 4435 was firstly searched in the NCBI database. The xylose reductase gene sequence was optimized according to the codon bias of E. coli, and the optimized xylose reductase gene was subcloned into a plasmid. The ApaI and Xhol cleavage sites of pET28a and the composition of a new plasmid. The newly composed plasmid is introduced into E.coli BL21(DE3) strain by heat shock transformation, and the result of enzyme digestion showed that the plasmid was successfully introduced. The recombinant E. coli was then transferred to a liquid medium containing resistant LB for induced expression of xylose reductase, and the crude enzyme solution obtained by ultrasonic disruption and centrifugation was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, according to the result of electrophoresis. It was shown that xylose reductase induced expression. The crude enzyme solution was extracted with a UV spectrophotometer at 340 nm to determine the enzyme activity of the crude enzyme solution. Finally, the specific activity of the crude enzyme solution was calculated based on the measured protein content.，preparation for subsequent enzyme catalysis experiments.

Key words: Xylose reductase Heat shock conversion Induced expression Enzyme activity assay

目 录

摘 要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 木糖醇简介 1

1.2.1 木糖醇的理化性质 1

1.2.2 木糖醇的药用性质 1

1.2.3 木糖醇的应用 2

1.3 木糖醇的生产 5

1.3.1 提取法 5

1.3.2 化学合成法 6

1.3.3 生物法 7

1.4 木糖在微生物体内的生化途径 7

1.5 发展趋势 8

1.5.3 采用基因工程的方法 8

1.5.3 对培养液改良的方法 8

第二章 材料与方法 10

2.1 材料 10

2.1.1 菌株和质粒 10

2.1.2 实验试剂和药品 10

2.1.3 试剂配制 10

2.1.4 培养基 10

2.1.5 实验仪器和设备 11

2.2 实验方法 11

2.2.1 目的基因查找 11

2.2.2 重组质粒构建 11

2.2.3 重组质粒导入大肠杆菌 13

2.2.4 木糖还原酶的诱导 14

2.2.5 粗酶液酶活的检测 15

第三章 结果与讨论 16

3.1 结果 16

3.1.1 电泳分析 16

3.1.2 木糖还原酶的活性检测 16

3.1.3 蛋白质含量的测定 17

3.1.4 比活力的计算 18

3.2 讨论 18

第四章 结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

第一章 文献综述

1.1引言

木糖醇是一种广泛应用的天然物质，具有很多优良的特性。随着经济的不断发展，人们开始将木糖醇应用到各种行业，木糖醇的需求不断增大，但是木糖醇的生产时间不久，相关技术落后。木糖醇虽然存在于自然界的很多植物中，如玉米，甘蔗和桦木等^[1]，但是提取工艺匮乏，传统的木糖醇生产条件严格，过程繁多，使得生产成本很高，所以木糖醇的产量和效率很低。面对日益增长的市场需求，目前的落后的生产技术完全不能满足社会的要求，国内外科研人员开始探索木糖醇新的生产途径来简化生产过程，降低生产成本。经过不断努力，人们研究出使用生物方法来生产木糖醇，相较于传统方法，生物转化法反应条件温和，产品纯度高，生产成本比较低，成为一种可行的木糖醇生产途径，因此利用引起了世界各国的关注。

1.2木糖醇简介

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