论文总字数：16509字

摘 要

D-海因酶是5＇取代海因用来制备含手型的氨基酸的关键酶。通过同源建模法建立A2W29海因酶的三维结构，经过各种软件评价，此模型可以进一步研究。将A2W29海因酶与底物进行分子对接，得到能量最低的结合位置，然后将对接好的底物进行突变，选择了底物范围内5A的氨基酸先进行了丙氨酸扫描，后通过比对1K1D ,1YNY,4LCS,1GKQ,1NFG(6种PDB数据库中的D-海因酶)来定向突变氨基酸残基，寻找提高海因酶结合底物的途径。

关键词：海因酶 分子对接 定点突变 同源建模

Abstract

Hydantoinase is a key enzyme for the preparation of chiral amino acids.The 3d structure of A2W29 Hydantoinase was established by homologous modeling method.The molecular docking of A2W29 Hydantoinase with the substrate was carried out to obtain the binding position with the lowest energy. Then the substrate was mutated. The amino acid of 5A within the range of the substrate was selected for alanine scanning first, and then 1K1D,1YNY,4LCS,1GKQand 1NFG were compared.(Hydantoinase in 6 PDB databases) were used to target mutant amino acid residues and find ways to improve the binding substrates of Hydantoinase

Key word: Hydantoinase; molecular docking;mutagenesis;homologous modeling

目 录

摘要 1

Abstract 1

第一章 绪论 3

1.1海因酶的介绍………………………………………………………………………………3

1.2海因酶催化特性和反应机理 3

第二章 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 同源建模 6

2.2.2 分子对接 6

2.2.3定点突变 9

2.3实验软件 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 海因酶的同源建模 10

3.2模型质量评估 10

3.2.1 PROCHECK评价 12

3.2.2ERRAT评价 13

3.3分子对接及其结果 15

3.4氨基酸位点突变及结果 19

第四章 总结 22

4.1总结 22

参考文献 25

致 谢 26

第一章 绪论

1.1海因酶的介绍

D-氨基酸是一种重要的非天然氨基酸，在自然界中分布非常广泛，如细菌细胞壁的肽聚糖^[1]。还有抗菌肽^[2]。而且，一些游离态D-氨基酸，具有一定的生理功能，如老鼠大脑中含有D-丝氨酸^[3] 。 D-氨基酸及其衍生物是医药、农药、和食品等精细化中的重要原料^[4]。例如： D-对羟基苯甘氨酸是β-内酰胺类抗生素的重要手性中间体， D- 缬氨酸可应用于合成杀虫剂， 而D-丙氨酸是生产人造甜味剂—阿斯巴甜的重要原料 ^[4] 。鉴于D-氨基酸的重要作用，目前已有报道采用化学法、发酵法以及海因酶 /氨甲酰酶、乙内酰胺酶、酯酶、氨基转移酶、酮酸脱氢酶等酶催化方法用于D-氨基酸的合成， 而海因酶法也是用于制备光学纯手性氨基酸最高效和广泛应用的方法之一^[5]。

海因酶( Hydantoinase，HDTase)是一类催化海因、5＇-单取代海因及其衍生物环酰胺键断裂的酰胺水解酶，在工业上具有广泛价值，主要用于生产D型和L型氨基酸^[5]。海因酶归类于环酰胺酶，依据其作用不同分为四类：二氢嘧啶酶,尿囊酶,羧甲基海因酶,N-甲基海因酶,另外还有一些未命名的海因酶，包括代谢途径已知的酰胺酶，羧乙基海因酶及一些代谢机理尚不清楚的海因酶,根据其作用的底物的特异性或产物的光学活性不同，还可以分为L型，D型，DL型^[6]。

1.2海因酶催化特性和反应机理

海因酶是D-型氨基酸转化过程中第一步需要的酶。 例如当5位取代位苯环时，也就是以D-苯海因反应底物时，在D-海因酶的催化作用下首先生成 N-氨甲酰基-D-苯甘氨酸产物再在N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的作用下生成D-苯甘氨酸 ( D-PG)^[6] 。

海因酶是特别依赖金属的酶，往海因酶中加入不同的金属离子可以激活酶，同时也可以添加金属螯合剂，再激活已经失活的^[7]。，各种不同的影响因素可能导致激活和再激活的结果产生差别，例如溶剂的类型，温度以及PH和金属的浓度等等，通过氨基酸序列同源性分析表明，水解环酰胺键的酰胺水解酶序列中保守的组氨酸残基可能与酰胺酶的金属结合有关^[8]。来自A .aurescens DSM 3745 的海因酶经原子吸收光谱和电感耦合等离子体／原子发射光谱鉴定^[9] 。且摩尔亚基含有 2.5摩尔 Zn^{2 [10]}。 通过对酶的化学修饰证明组氨酸与 Zn2 的结合有关^[10] 。Zn² 通过结合可能对酶的结构、 催化基团和调节基团都有重要的作用^[6]。

1. 材料与方法

2.1实验材料

本实验以来源于Gemmatimonadetes bacterium RBG_16_66_8的海因酶为模板蛋白（序列号A2W29_12595）文章中讨论过的其他海因酶数据都来自于PDB数据库（https://www.rcsb.org/）。

2.2实验方法

2.2.1同源建模

同源建模，也称为蛋白质的比较建模，在进化过程中，类似的蛋白质具有相差不大的序列，自然界中本身有的同源蛋白质具有相似的蛋白质三维结构^[11]。而且通过大量的研究发现，相比于氨基酸序列的保守性来看，蛋白质结构在进化上更加保守，因为很多时候即使是相同位点上不同的氨基酸也有相同和相似的结构，总的来说，各种性质相似的氨基酸组成的序列也会有着类似的蛋白质结构与之对应^[12]。同源建模的具体操作：(1)寻找一个与目标序列同源性较好的的已知蛋白质结构作为我们同源建模的模板，目标氨基酸序列与找到的模板序列间的相似性要在30%以上^[13]。(2)让目标氨基酸序列与多条寻找的一条或者多条模板序列进行序列比对，让模板序列一致度高的片段尽可能覆盖整个目标序列，尽量避免没有模板参考的段口。(3)有了序列比对就可以将目标序列里面的氨基酸根据比对结果对应到相应模板结构里的氨基酸所在的空间位置。(4)评估模型质量，查看模型质量是否合格。这些步骤需要专门的软件，并集成最新的蛋白质序列和结构数据库。以上每一个步骤都可以交互地重复，直到得到满意的建模结果为止^[13]。

2.2.2 分子对接

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